肺炎支原體快速培養(yǎng)法與抗原量子點(diǎn)免疫層析法快速檢測(cè)技術(shù)在支原體肺炎診斷中的應(yīng)用

王貴萍

(深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518001)

支原體肺炎(MP)是一種臨床上小兒呼吸道感染常見病原體，以呼吸道傳染最為多見，一旦感染，會(huì)對(duì)全身各臟器造成損傷。診斷MP常采用冷凝集素及血清特異性抗體檢測(cè)，但受到各種因素制約，其效果不佳[1]。近年來發(fā)展的抗原量子點(diǎn)免疫層析法快速檢測(cè)技術(shù)及MP快速培養(yǎng)法均具有快速、靈敏度高優(yōu)點(diǎn)[2-3]。為了客觀評(píng)價(jià)此兩種診斷方法，深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院以80例MP病人作為研究對(duì)象，探討肺炎支原體快速培養(yǎng)法與抗原量子點(diǎn)免疫層析法快速檢測(cè)技術(shù)在支原體肺炎診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次80例支原體肺炎病人均為本院2015年6月至2016年6月所收治，其中男48例，女32例，年齡5個(gè)月～14歲，平均(4.27±0.42)歲。

1.2 方法

快速培養(yǎng)法：于清晨采集咽試子標(biāo)本，快速置于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基購(gòu)自武漢菁華時(shí)間科技公司，在瓶中攪動(dòng)，靠緊瓶壁擠去多余殘液，隨后去除咽試子多余部分，蓋上瓶蓋后，將培養(yǎng)瓶放于37 ℃孵箱中，待6 h后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果判斷：培養(yǎng)基顏色若由紅色變?yōu)辄S色，視為陽性。

抗原量子點(diǎn)免疫層析法快速檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)：1)主要試劑：粘性PVC底板(Whatman)；硝酸纖維素膜(Millipore M180，批號(hào)R3EA25725)；吸水紙(Whatman，型號(hào)CF6，批號(hào)B202AD0274)；1-乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)(偶聯(lián)劑，Sigma公司E7750)；玻璃纖維膜(Whatman，型號(hào)Accuflow G，批號(hào)13537975)；選用北京義翹神州生物科技有限公司制造的肺炎支原體多克隆抗體(兔抗人Mp多抗，濃度3 mg·mL-1)；選用北京博生福生物技術(shù)有限責(zé)任公司制造的Mp重組抗原(分子量30 KD，濃度6.8 mg·mL-1)。肺炎支原體單克隆抗體2株(1#和2#，針對(duì)Mp P1蛋白抗原)；選用上海熹垣生物科技有限公司制造的巰基丁二酸(規(guī)格：500 g；型號(hào)：XY-201-01055)；選用上海榕柏生物技術(shù)有限公司制造的N-羥基琥珀酰亞胺(規(guī)格：500 g；型號(hào)：K-1305)；選用上海鈺博生物科技有限公司制造的核殼型硒化鎘(規(guī)格：g·mg-1；型號(hào)：YBC119246)量子點(diǎn)，發(fā)射波長(zhǎng)為625 nm；采用南京比迪生物科技有限公司制造的羊抗兔球蛋白抗體(規(guī)格：mg；型號(hào)BD-B02029)。2)儀器設(shè)備：選則北京富眾科技發(fā)展有限公司制造的大平面三維平臺(tái)HM3230噴膜儀，切條儀采用Bio-dot公司制造。3)a. NC膜的包被：C線選則方法為將二抗進(jìn)行稀釋，一直稀釋到適宜濃度后噴膜，T線選則方法為對(duì)Mp單抗進(jìn)行稀釋，一直稀釋到適宜濃度后噴膜，隨后將膜進(jìn)行干燥。b.量子點(diǎn)的偶聯(lián)：將1 mL巰基丁二酸加入25 μL QDs展開離心洗滌30 min，轉(zhuǎn)速為18 000 r·min-1，去除上清液，再次洗滌一次；將一定量的碳二亞胺加入巰基丁二酸進(jìn)行30 min活化，轉(zhuǎn)速18 000 r·min-1，洗滌兩次，每次均需去除上清液。之后將二抗加入其中并室溫孵育，待2 h后，將10%牛血清白蛋白加入其中，封閉30 min后展開離心，離心方式同上；最后加入25 μL保存液進(jìn)行保存。4)量子點(diǎn)的噴膜：取10 μLQDs，此QDs必須偶聯(lián)有抗體，稀釋LQDs至適合濃度，調(diào)整噴膜機(jī)噴量至10 μL·cm-1，噴于玻璃纖維素膜，將玻璃纖維素膜置于37 ℃下干燥2 h。5)試紙條的制備：于粘性PVC底板上依次搭接量子點(diǎn)結(jié)合物墊、吸水紙以及NC膜，需要注意的是各個(gè)材料搭接時(shí)應(yīng)相互重疊2 mm。搭接好后切割成3.5 mm寬的試紙條。6)試紙條檢測(cè)方法和結(jié)果判定：吸取50 μL梯度稀釋的重組抗原置于試紙條末端，3 min后將試紙條置于紫外燈下目測(cè)結(jié)果，T帶熒光帶在C帶顯示紅色熒光帶。取咽部拭子，加入1 mL洗脫液充分?jǐn)噭?，再使用上述方法進(jìn)行檢測(cè)和判斷。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩種檢測(cè)方法的陽性率、靈敏度、特異度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

快速培養(yǎng)法與免疫層析法陽性率、靈敏度、特異度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩種檢測(cè)陽性率、靈敏度、特異度對(duì)比

3 討論

MP感染在近幾年引發(fā)呼吸道疾病的發(fā)生率上呈不斷上升趨勢(shì)，此類感染好發(fā)于兒童，傳播途徑為健康人群吸入或接觸到MP患者排出的分泌物，由于兒童抵抗力較弱，發(fā)生率較高[4-5]。其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，且病情程度輕重不等，易反復(fù)，病程長(zhǎng)，還會(huì)并發(fā)肺外并發(fā)癥，對(duì)患者生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響[6]。

肺炎支原體是一種對(duì)人有明顯致病性的病原體，它能引起原發(fā)性非典型肺炎即臨床所說的MP，是一種沒有細(xì)胞壁，專性細(xì)胞內(nèi)寄生能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的介于病毒和細(xì)菌之間的病原微生物，生長(zhǎng)緩慢，需23周以上。MP所致的呼吸道感染體征與常見的病毒感染、細(xì)菌極為相似，臨床鑒別難度較大；支原體結(jié)構(gòu)獨(dú)特，其致病機(jī)理復(fù)雜，常規(guī)治療難以收效，感染發(fā)病后若得不到及時(shí)的診治容易誘發(fā)多種并發(fā)癥；臨床上對(duì)肺炎支原體感染的診斷要求是要做到快速、準(zhǔn)確，而現(xiàn)有的檢測(cè)方法不能保證這方面的要求，建立一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法是目前臨床醫(yī)患雙方的迫切要求。臨床上對(duì)支原體肺炎病人通常采用冷凝集素及血清特異性抗體檢測(cè)，此種檢測(cè)方法雖然有一定效果，因其兩種方法易受到外界因素影響，檢測(cè)效果不佳[7]。查琳等[8]研究表明，早期進(jìn)行MP檢查，對(duì)及時(shí)診斷及指導(dǎo)臨床用藥極其重要。本研究表明，在靈敏度及特異度上，兩組檢測(cè)方法相比，抗原量子點(diǎn)免疫層析法顯著高(P<0.05)，在陽性率上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

隨著現(xiàn)今科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，醫(yī)療水平不斷提升，當(dāng)前微生物檢測(cè)技術(shù)不斷突破，主要是由于微生物快速培養(yǎng)新技術(shù)的不斷應(yīng)用。尤其是病原體的檢測(cè)是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域公認(rèn)的發(fā)展方向和必經(jīng)的步驟。Mp具有散在性、區(qū)域性流行的特點(diǎn)，利用Mp快檢試劑在流行期可迅速查找、隔離病原體，因此開展肺炎支原體快速檢測(cè)對(duì)Mp感染的早期診治，積極預(yù)防，合理選擇使用抗生素對(duì)保護(hù)患者身心健康，防止誘發(fā)其他并發(fā)癥極為重要?？焖倥囵B(yǎng)法是一種可以直接檢測(cè)MP病原體的實(shí)驗(yàn)室方法，具有快速、簡(jiǎn)便、敏感優(yōu)點(diǎn)，能在發(fā)病初期檢測(cè)到MP，原因在于其培養(yǎng)液中含有快速生長(zhǎng)因子和高營(yíng)養(yǎng)成分，致使標(biāo)本中病原體快速增殖，在12 h得出結(jié)果。由于MP特異性抗體受檢測(cè)時(shí)機(jī)的限制對(duì)MP感染的早期診斷價(jià)值有限，選擇Mp快速培養(yǎng)法12 h得出結(jié)果作為早期檢測(cè)，有助于臨床醫(yī)師實(shí)踐支原體肺炎臨床路徑，規(guī)范治療，減少成本，對(duì)臨床診斷具有重要意義。利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法改進(jìn)其各種性能，推出MP快速培養(yǎng)試劑，加強(qiáng)MP檢測(cè)的特異性、靈敏度，使疾病的診斷更加準(zhǔn)確、快速簡(jiǎn)便。缺點(diǎn)在于特異性不是很高，在本研究中特異度僅為72.5%。

目前量子點(diǎn)免疫層析技術(shù)是臨床上研究的熱點(diǎn)，20世紀(jì)初誕生的量子物理學(xué)使世界發(fā)生了天翻地覆的變化，量子物理學(xué)不但影響到化學(xué)、物理學(xué)，而且波及到傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，大約在1950年左右，國(guó)外開始將量子理論應(yīng)用到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在20世紀(jì)80年代末，美國(guó)開始將量子醫(yī)學(xué)用于臨床診斷，之后迅速在日本、德國(guó)、韓國(guó)等國(guó)家得到發(fā)展。我國(guó)對(duì)量子醫(yī)學(xué)的研究始于20世紀(jì)90年代末，在國(guó)內(nèi)尚屬方

興未艾的新型醫(yī)學(xué)。量子醫(yī)學(xué)是當(dāng)今最先進(jìn)的檢查科技。在本文中采用NHS交聯(lián)劑與EDC共價(jià)鍵連接，對(duì)兔抗人MP多克隆抗體進(jìn)行量子點(diǎn)標(biāo)記，由于EDC與量子點(diǎn)中的羧基反應(yīng)得到酰基異脲，?；愲逶倥cNHS反應(yīng)生成NHS酯，最終于MP多抗中的氨基反應(yīng)生成酰胺，從而與MP多抗進(jìn)行偶聯(lián)。該反應(yīng)體系還有以下特點(diǎn)：1)能夠避免與其他呼吸道常見菌交叉反應(yīng)，特異性高。2)能在早期診斷，可直接檢測(cè)人咽拭子Mp抗原。3)檢測(cè)時(shí)間短，僅需3 min。

綜上所述，雖然在陽性率上兩種檢測(cè)無顯著差異，但量子點(diǎn)免疫層析技術(shù)優(yōu)勢(shì)更多，靈敏度及特異度更高。