荔枝核皂苷對糖調(diào)節(jié)受損大鼠胰腺組織氧化應(yīng)激的改善作用及其機制

黃凱文，李阿榮，鄧志軍，劉若軒，李常青，鐘世順，郭潔文，張 潔，陳 濱

(1.南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院藥物臨床試驗機構(gòu)，廣東 順德528308；2.廣東省廣州市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州510130；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州510006；4.廣東省生物制品與藥物研究所，廣東 廣州510440)

糖調(diào)節(jié)受損(impaired glucose regulation，IGR)是介于正常血糖與糖尿病之間一種糖調(diào)節(jié)失衡表現(xiàn)，包括空腹血糖受損和糖耐量受損[1]。IGR是2型糖尿病(T2DM)的主要危險因素，核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素加氧酶1(HO-1)信號通路在IGR和T2DM中起重要作用，活化Nrf2/HO-1信號通路可有效防止或延緩上述病程的發(fā)展[2-3]。荔枝核為國家藥典收載嶺南道地藥材，荔枝核及其皂苷(saponin of litchi seed，SL)可明顯改善高糖-高脂飲食誘導(dǎo)高脂血癥-胰島素抵抗-脂肪肝模型大鼠、地塞米松致胰島素抵抗模型大鼠的血糖、血脂、胰島素、瘦素、胰島素敏感指數(shù)(ISI)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)等指標，并明顯改善高脂血癥-胰島素抵抗-脂肪肝模型大鼠的肝、腎功能及組織病理學(xué)改變[4-6]。本實驗采用高糖高脂飼料建立IGR大鼠模型，研究SL通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號通路抗氧化應(yīng)激進而改善IGR的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和飼料 SPF級SD大鼠72只，雌雄各半，體質(zhì)量180～200 g，由廣東省實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0002?；A(chǔ)飼料由廣東省實驗動物中心提供，配方：11%脂肪，21%蛋白質(zhì)，68%碳水化合物；高脂飼料配方由本實驗室前期研究確定，委托廣東省實驗動物中心加工，配方：43.6%基礎(chǔ)飼料，20%豬油，15%蔗糖，15%蛋黃粉，5%酪蛋白，1.2%膽固醇，0.2%膽酸鈉。

1.2 藥物、主要試劑和儀器 荔枝核藥材購于廣州采芝林藥業(yè)有限公司(批號：YPA3C0001)，經(jīng)廣東省生物制品與藥物研究所副主任藥師鐘世順鑒定為無患子科植物荔枝(LitchichinensisSonn.)的干燥成熟種子。SL提取方法：荔枝核經(jīng)70%乙醇超聲提取，濾液減壓濃縮回收乙醇后經(jīng)大孔吸附樹脂柱，用70%乙醇洗脫，得SL，含量為83.5%。鹽酸二甲雙胍片，中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：1407082；總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、SOD和MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號分別為A111-1、A110-1、A112-1、A113-1、A001-3、A003-1；總RNA提取試劑Trizol，美國Invitrogen產(chǎn)品，批號：15596026；ReverTra Ace qPCR RT Kit及SYBR?Green Real-time PCR Master Mix，日本TOYOBO公司產(chǎn)品，批號：135600和26200；HO-1、SOD、MDA和β-actin引物由日本TaKaRa公司設(shè)計合成；Nrf2一抗，美國Santa Cruz產(chǎn)品，批號：sc-722；HO-1和β-actin一抗，美國CST公司產(chǎn)品，批號分別為5853和4970；核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒，凱基生物有限公司，批號：KGP1100；ECL檢測試劑盒，美國Thermo公司產(chǎn)品，批號：32019；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，由廣州浩瑪生物科技有限公司提供。羅氏卓越型羅康全精密血糖儀和血糖試紙，瑞士羅氏制藥公司；奧林巴斯AU 5400全自動生化分析儀，美國貝克曼公司；5810R高速冷凍離心機，美國Thermo公司；7500熒光定量PCR儀，美國ABI公司；Synergy HT多功能酶標儀，美國BioTek公司；POWER/PAC 1000電泳儀、POWER/PAC Universal電轉(zhuǎn)裝置和GS-800光密度掃描儀，美國BIO-RAD公司。

1.3 動物模型制備、分組和給藥 造模方法參照參考文獻[7-8]：72只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機選取12只作為正常對照組，以基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)；其余60只采用高脂飼料飼養(yǎng)造模。大鼠連續(xù)喂養(yǎng)12周后，禁食16 h不禁水，灌胃給予50%葡萄糖2 g·kg-1，尾靜脈采血，檢測空腹血糖(FBG)水平，并進行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)，以FBG 6.1～7.0 mmol·L-1、OGTT 2 h血糖7.8～11.1 mmol·L-1為造模成功標準。將造模成功大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組(0.2 g·kg-1，相當(dāng)于成人臨床用藥劑量的2倍)、低劑量SL組(0.05 g·kg-1，相當(dāng)于成人臨床用藥劑量的0.1倍)、中劑量SL組(0.1 g·kg-1，相當(dāng)于成人臨床用藥劑量的0.2倍)和高劑量SL組(0.2 g·kg-1，相當(dāng)于成人臨床用藥劑量的0.4倍)，每組12只。二甲雙胍組及低、中和高劑量SL組大鼠均灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥6周，正常對照組及模型組大鼠灌服等體積生理鹽水。給藥期間正常對照組大鼠給予基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)，其余各組大鼠繼續(xù)給予高脂飼料飼養(yǎng)，每周末次給藥后，大鼠禁食16 h尾靜脈采血，檢測FBG。

1.4 OGTT及FBG和血脂水平檢測 OGTT：給藥6周末，大鼠禁食16 h，檢測FBG后，灌胃給予50%葡萄糖2 g·kg-1，于30、60和120 min自大鼠尾靜脈取血，血糖儀檢測血糖水平。OGTT結(jié)束后，全部大鼠禁食16 h，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血，分離血清，采用全自動生化分析儀檢測FBG和血脂(CHOL、TG、HDL-C及LDL-C)水平。

1.5 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)法檢測大鼠胰腺組織中SOD、MDA和HO-1 mRNA表達水平 各組隨機抽取4只大鼠，取胰腺組織，以Trizol法提取胰腺組織RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。RNA樣品經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA模板，隨后參照試劑盒進行PCR，反應(yīng)體系為cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，SYBRGreen PCR Mix 12.5 μL，DEPC H2O補足總體積至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)，每次擴增設(shè)置β-actin為內(nèi)參對照。采用美國ABI公司自帶的PCR系統(tǒng)軟件分析，觀察擴增曲線，計算樣本歸一化的每個反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct 值)、目的基因Ct 值與內(nèi)參Ct 值之差△Ct和各組△Ct與正常對照組△Ct之差△△Ct，以△△Ct值的負數(shù)為指數(shù)計算2-△△Ct，即代表SOD、MDA和HO-1 mRNA表達水平。引物序列及擴增產(chǎn)物大小見表1。

表1 引物序列和擴增產(chǎn)物大小

1.6 Western blotting法檢測大鼠胰腺組織中HO-1和Nrf2蛋白表達水平 各組隨機抽取大鼠4只，取胰腺組織，按說明書提取全細胞、胞核和胞質(zhì)蛋白并測定蛋白濃度。每孔上樣50 μg，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗溶液(HO-1 1∶800，Nrf2 1∶500，β-actin 1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，10 min/次，共3次，HRP標記的二抗溶液(1∶15 000)室溫孵育2 h，上述方法洗膜后加入ECL液顯色曝光。使用IPWIN60 圖像分析軟件對條帶灰度進行分析，以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與β-actin灰度值比值表示蛋白表達水平。計算Nrf2核轉(zhuǎn)位率代表Nrf2活化程度，核轉(zhuǎn)位率=細胞核蛋白表達水平 /(細胞核蛋白表達水平+細胞漿蛋白表達水平)× 100%。

1.7 氧化應(yīng)激指標檢測 取大鼠胰腺組織，以PBS制成10%勻漿液，3 500 r·min-1、4 ℃離心15 min，取上清液，按試劑盒說明書檢測SOD活性和MDA水平。

2 結(jié) 果

2.1 給藥前后各組大鼠FBG水平 給藥前，與正常對照組比較，各組大鼠FBG水平均明顯升高(P<0.05)，但各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給藥后，與正常對照組比較，模型組大鼠FBG水平在各時間點均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組和高劑量SL組大鼠FBG水平在各時間點均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，中劑量SL組大鼠FBG在給藥后4、5和6周明顯降低(P<0.05或P<0.01)，但低劑量SL組大鼠FBG水平無明顯變化(P>0.05)。見表2。

表2 給藥前后各組大鼠FBG水平

Tab.2 Levels of FBG of rats in various groups before and after administration

GroupLevel of FBG (week) 0123456Normal control4.59±0.164.61±0.134.70±0.124.68±0.234.72±0.124.64±0.134.65±0.53Model 6.78±1.23?6.62±1.29?6.89±1.05?6.72±1.23?6.85±1.27?6.87±1.25?6.88±1.34?Metformin6.97±1.29?5.16±1.64△△5.31±1.18△△5.43±1.57△△5.86±1.08△5.74±1.19△5.56±1.29△△SL Low6.51±1.08?6.6±1.256.73±1.066.37±1.196.31±1.066.54±1.116.58±1.06 Medium6.95±1.28?6.89±1.046.31±1.016.28±1.095.85±0.54△5.87±0.89△5.95±0.57△ High6.72±0.85?5.88±0.93△5.96±0.9△6.12±1.09△5.93±1.02△5.65±1.06△△5.76±1.01△△

*P<0.05vsnormal control group；△P<0.05，△△P<0.01vsmodel group.

2.2 OGTT結(jié)果 與正常對照組比較，模型組大鼠各時間點血糖水平均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，二甲雙胍組和中、高劑量SL組大鼠各時間點血糖水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 OGTT中各組大鼠各時間點血糖水平

Tab.3 Levels of blood glucose of rats in various groups at different time points in OGTT

GroupBlood glucose(t/min) 0 3060120Normal control4.82±0.467.85±0.737.42±0.625.68±0.53Model 10.88±3.62?11.05±3.83?11.03±3.94?10.46±2.54?Metformin7.15±1.69△9.69±1.17△9.77±6.88△7.03±5.37△△SL Low9.95±1.1310.58±2.1210.54±2.2510.05±2.63 Medium7.02±4.289.65±1.13△9.52±1.54△7.65±1.26△△ High7.25±2.05△9.85±1.38△9.56±1.23△7.05±1.59△△

*P<0.01vsnormal control group；△P<0.05，△△P<0.01vsmodel group.

2.3 各組大鼠血脂水平 與正常對照組比較，模型組大鼠血清中CHOL、TG和LOL-C水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，二甲雙胍組和中、高劑量SL組大鼠TG水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，低劑量SL組大鼠血脂水平無明顯變化(P>0.05)。見表4。

表4 給藥6周后各組大鼠血脂水平

Tab.4 Levels of blood lipids of rats in various groups 6 weeks after adminstration

GroupCHOLTGHDL-CLDL-CNormal control1.45±0.260.37±0.130.52±0.080.24±0.03Model 2.28±0.48??1.65±0.83??0.65±0.090.46±0.24?Metformin2.01±0.690.43±0.34△△0.57±0.080.38±0.27SL Low2.15±0.511.67±2.120.57±0.050.47±0.15 Medium2.12±0.480.85±0.83△0.54±0.040.46±0.23 High2.05±0.450.41±0.29△△0.56±0.060.36±0.12

*P<0.05，**P<0.01vsnormal control group；△P<0.05，△△P<0.01vsmodel group.

2.4 各組大鼠胰腺組織中SOD活性和MDA水平 與正常對照組比較，模型組大鼠胰腺組織中SOD活性降低(P<0.01),MDA水平升高(P<0.01)；與模型組比較，二甲雙胍組和中、高劑量SL組SOD活性升高(P<0.05或P<0.01)，MDA水平降低(P<0.05或P<0.01)，而低劑量SL組大鼠胰腺組織中SOD活性和MDA水平無明顯變化(P>0.05)。見表5。

表5 給藥6周后各組大鼠胰腺組織中SOD活性和MDA水平

GroupSOD[λB/(kU·L-1)]MDA[cB/(μmol·L-1)]Normal control23.37±0.1330.34±1.95Model 13.65±2.83?40.69±2.03?Metformin20.89±5.07△△31.41±3.69△△SL Low15.67±4.5239.38±3.31 Medium19.85±4.38△35.11±2.72△ High21.34±2.07△△32.38±3.26△△

*P<0.01vsnormal control group；△P<0.05，△△P<0.01vsmodel group.

2.5 各組大鼠胰腺組織中SOD、MDA和HO-1 mRNA表達水平 與正常對照組比較，模型組大鼠胰腺組織中MDA和HO-1 mRNA表達水平升高(P<0.05或P<0.01)，SOD mRNA表達水平降低(P<0.05)。與模型組比較，二甲雙胍組和中、高劑量SL組大鼠胰腺組織中SOD和HO-1 mRNA表達水平升高(P<0.05或P<0.01)，MDA表達水平降低(P<0.05或P<0.01)。見表6。

表6 給藥6周后各組大鼠胰腺組織中SOD、MDA和HO-1 mRNA表達水平

GroupSODmRNAMDAmRNAHO-1mRNANormal control1.00±0.021.00±0.031.00±0.03Model 0.35±0.08??1.69±0.23??1.59±0.21?Metformin1.13±0.14△△0.52±0.07△△2.58±0.29△△SL Low0.51±0.091.48±3.311.67±0.43 Medium0.85±0.12△1.19±0.24△2.23±0.27△△ High1.04±2.07△△0.95±0.27△△2.65±0.32△△

*P<0.05，**P<0.01vsnormal control group；△P<0.05，△△P<0.01vsmodel group.

2.6 各組大鼠胰腺組織中HO-1和Nrf2蛋白表達水平及核轉(zhuǎn)位率 與正常對照組比較，模型組大鼠胰腺組織中HO-1蛋白表達水平升高(P<0.01)；與模型組比較，二甲雙胍組和中、高劑量SL組大鼠胰腺組織中HO-1蛋白表達水平升高(P<0.05)。與正常對照組比較，模型組大鼠胰腺組織中胞質(zhì)和胞核Nrf2蛋白表達水平和核轉(zhuǎn)位率明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，二甲雙胍組和中、高劑量SL組胰腺組織中胞質(zhì)Nrf2蛋白表達水平降低(P<0.05或P<0.01)，胞核Nrf2蛋白表達水平及核轉(zhuǎn)位率升高(P<0.05或P<0.01)。見圖1、2和表7。

表7 各組大鼠胰腺組織中HO-1和Nrf2蛋白表達水平及核轉(zhuǎn)位率

GroupHO-1 proteinNrf2 proteinNucleusCytoplasm Nrf2 nucleus translocation rate (η/%)Normal control0.31±0.020.25±0.050.17±0.0325.74±4.94Model 0.73±0.22?0.68±0.18?1.25±0.23?35.76±3.92?Metformin1.15±0.26△1.25±0.34△△0.75±0.27△△45.72±4.29△△SL Low0.58±0.320.37±0.071.17±0.2726.65±4.32 Medium0.98±0.11△0.85±0.12△0.95±0.34△40.54±5.36△△ High1.23±0.36△1.13±0.39△△0.84±0.31△42.93±3.57△△

*P<0.01vsnormal control group；△P<0.05，△△P<0.01vsmodel group.

Lane 1: Normal control group；Lane 2: Model group；Lane 3: Low dose of SL group；Lane 4: Medium dose of SL group；Lane 5: High dose of SL group；Lane 6: Metformin group.

圖1 各組大鼠胰腺組織中HO-1蛋白表達電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expression levels of HO-1 proteins in pancreas tissue of rats in various groups

Lane 1: Normal control group；Lane 2: Model group；Lane 3: Low dose of SL group；Lane 4: Medium dose of SL group；Lane 5: High dose of SL group；Lane 6: Metformin group.

圖2 各組大鼠胰腺組織中Nrf2蛋白表達電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expression levels of Nrf2 protein in pancreas tissue of rats in various groups

3 討 論

IGR是T2DM前期，主要表現(xiàn)為胰島β細胞胰島素分泌功能受損。IGR患者血清中多種炎癥因子水平明顯升高，由此引發(fā)的氧化應(yīng)激作用會加重胰島β細胞損害及胰島素抵抗(IR)，使糖尿病前期向糖尿病轉(zhuǎn)變[9]。研究[10-11]顯示：活性氧簇(ROS)生成參與胰島β細胞死亡及功能損傷，血糖水平長期偏高誘導(dǎo)氧化應(yīng)激發(fā)生，細胞自身通過抗氧化酶及抗氧化分子清除ROS以抑制氧化應(yīng)激。Nrf2是調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，正常狀態(tài)下，Nrf2通路活性被抑制，細胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，Nrf2與其特異性受體Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap 1)解離，發(fā)生核轉(zhuǎn)位進入細胞核，并激活抗氧化反應(yīng)元件(ARE)調(diào)控的抗氧化酶基因包括HO-1、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等的表達，促進ROS清除、增加谷胱甘肽合成、還原醌類化合物和解毒外源性化學(xué)物質(zhì)等，保護其免受氧化應(yīng)激損傷，維持細胞內(nèi)氧分壓動態(tài)平衡[12-14]。以Nrf2基因缺失(Nrf2-/-)小鼠作為模型對該轉(zhuǎn)錄因子進行的系列研究[15-16]顯示：Nrf2-/-小鼠更易受到ROS、炎癥反應(yīng)及有毒代謝產(chǎn)物損傷。因此，研究活化Nrf2信號通路對防治IGR具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示：中、高劑量SL可調(diào)節(jié)大鼠脂質(zhì)代謝，修復(fù)并改善胰腺組織及糖耐量損傷，上調(diào)胰腺組織SOD活性、降低MDA及胰腺組織胞質(zhì)Nrf2蛋白水平，提高胞核Nrf2水平和Nrf2核轉(zhuǎn)位率，上調(diào)HO-1表達。Lee等[17]發(fā)現(xiàn)：糖尿病狀態(tài)下胰腺組織中HO-1表達增加，提示其可增強抗氧化作用，保護臟器。本研究結(jié)果顯示：伴隨Nrf2核轉(zhuǎn)位增加，胰腺組織中HO-1表達也隨之增強，推測HO-1參與IGR狀態(tài)下的抗氧化防御，提示SL具有改善糖脂代謝和增強抗氧化應(yīng)激效果，其作用機制可能與激活Nrf2/HO-1信號途徑，促進Nrf2核轉(zhuǎn)位以增強抗氧化物質(zhì)HO-1基因表達和蛋白合成有關(guān)，這與Lee等[17]報道相一致。本課題組前期研究[18]證實：荔枝核具有確切的改善IR作用，并從中分離了4個化合物，分別為豆甾醇、對羥基苯甲醛、胡蘿卜苷和山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。最新研究[19]顯示：荔枝核有效部位群(皂苷、黃酮、鞣質(zhì))能明顯改善T2DM-IR模型大鼠糖脂代謝，提高IR-3T3-L1細胞胰島素敏感性，增加其攝取和利用葡萄糖能力，進而改善IR，相關(guān)機制與降低抵抗素(RETN)、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子(CHOP)及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)基因mRNA表達有關(guān)。本文作者還將進一步探討T2DM形成的病理學(xué)機制是否與缺氧引起的線粒體生成缺陷及呼吸功能障礙有關(guān)聯(lián)，以證實SL防治IGR可能是通過促進線粒體生成和加速脂肪酸氧化分解實現(xiàn)的。