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    紅景天甙減輕大鼠酒精性肝損傷

    2018-07-27 01:12:36周光群
    中國病理生理雜志 2018年7期
    關(guān)鍵詞:紅景天灌胃酒精性

    張 華, 周光群

    (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1消化內(nèi)科, 2內(nèi)鏡科, 貴州 遵義 563000)

    隨著人們生活水平的提高,酒精消費(fèi)在人群中逐年升高,因此酒精所誘發(fā)的疾病亦日益增長。長期大量飲酒可導(dǎo)致肝細(xì)胞損害、脂質(zhì)過氧化及肝纖維化,繼而進(jìn)展為肝硬化。在我國,因長期大量飲酒導(dǎo)致的慢性肝病發(fā)生率呈明顯上升趨勢,已成為影響人類健康的隱形殺手。因此,對酒精性肝病的防治具有重大的臨床意義。紅景天為多年生草本植物,主要生長在海拔1 600~4 000米的高寒、缺氧、晝夜溫差大的地區(qū),屬于益氣活血類中藥。紅景天甙(salidroside)為紅景天主要有效成分,研究表明,紅景天甙有調(diào)節(jié)免疫、抗凋亡、抗纖維化、抗輻射及清除自由基等作用[1-4],但紅景天甙對酒精性肝損傷是否具有藥效,報(bào)道甚少。因此,本文采用56%乙醇灌胃誘導(dǎo)酒精性肝損傷模型,觀察紅景天甙對酒精性肝損傷大鼠血清甘油三酯(triacylglycerol,TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平及肝組織病理學(xué)變化的影響,探討其護(hù)肝作用及其可能機(jī)制,為紅景天甙的臨床藥用提供有效證據(jù)。

    材 料 和 方 法

    1 動物與試劑

    100只SD雄性大鼠,體重200~230 g,購自華西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒購自南京建成生物科技有限公司;腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB) ELISA試劑盒購自Biosource;兔抗鼠TNF-α和NF-κB抗體及兔抗鼠β-actin抗體購自Bioworld;TRIzol試劑盒購自北京天根;RT-PCR試劑盒購自TaKaRa;RT-PCR引物由上海生工合成;紅景天甙粉劑購自云南同持生物技術(shù)公司;聯(lián)苯雙酯(bifendate)滴丸購自浙江醫(yī)藥股份有限公司;其余試劑均為分析純。

    2 方法

    2.1動物模型的制作 100只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組(n=20):空白對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯滴丸(200 mg/kg)陽性對照組及紅景天甙低劑量和高劑量組,每組大鼠灌胃給藥,除空白組給予生理鹽水外,其余各組均給予56%乙醇灌胃,每天08:00給予56%乙醇灌胃1次,乙醇開始劑量為第 1 周10 mL/kg,以后每周遞增1 mL,持續(xù)灌胃4周,大鼠造模的同時(shí)給予藥物治療,每天13:00陽性對照組給予聯(lián)苯雙酯滴丸1次,紅景天甙組給予紅景天甙滅菌水溶液(20 mg/kg、40 mg/kg,濃度8 g/L)1次,空白組及模型組均給予生理鹽水,灌胃體積為10 mL/kg。 實(shí)驗(yàn)結(jié)束即第4周末,大鼠隔夜禁食12 h后麻醉狀態(tài)下心臟取血,分離血清,迅速解剖取出肝臟,剪取肝組織200 g制備組織勻漿,另取同一肝葉、同一位置、大小約0.5 cm×0.5 cm的肝組織,以40 g/L 多聚甲醛固定,部分肝組織-80 ℃冰箱保存。

    2.2指標(biāo)測定 (1)造模過程中觀察各組大鼠的體質(zhì)量和精神狀態(tài)等。(2)HE染色制作切片,光鏡下觀察大鼠肝組織病理學(xué)變化。(3)全自動血清生化儀檢測血清中TG、ALT和AST水平。(4)按試劑盒測定方法檢測MDA含量及SOD活性。(5)ELISA法檢測血清TNF-α和NF-κB含量,具體方法按說明書進(jìn)行。(6) Western blot法測定TNF-α和NF-κB的蛋白表達(dá):取出肝組織制備蛋白樣品,Bradford比色法測定蛋白濃度,取蛋白20 μg上樣量進(jìn)行SDS-PAGE,電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,室溫封閉1 h,經(jīng)電泳、抗體結(jié)合免疫,加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影成像,進(jìn)行蛋白條帶的灰度值測定,反映蛋白表達(dá)(以β-actin作為內(nèi)參照)。(7) RT-PCR測定TNF-α和NF-κB 的mRNA表達(dá)水平:參照TRIzol試劑盒說明書提取RNA后,采用RT-PCR半定量法檢測mRNA含量,以β-actin為內(nèi)參照。β-actin上游引物序列為5’-CTATCCTTCTTCGCAT-3’,下游引物序列為5’-TAATTGTCGCAGATCG-3’,產(chǎn)物為960 bp;TNF-α的上游引物序列為5’-TCAAAACTCGAGTGACA-3’,下游引物序列為5’-AGTGGGTTCTGTCTGAGCC-3’,產(chǎn)物為200 bp;NF-κB的上游引物序列為5’-GAGGTCCAGAGGGAAGT-3’,下游引物序列為5’-CACCGGTAACAAAGGCC-3’,產(chǎn)物為350 bp。PCR按照20 μL反應(yīng)體系加入引物和試劑,最后加入Taq酶,各擴(kuò)增管放置于PCR擴(kuò)增儀。反應(yīng)條件:94 ℃變性40 s、退火45 s(退火溫度分別為60 ℃、55 ℃和54 ℃)、72 ℃延伸60 s,共30個(gè)循環(huán),再72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳,在凝膠成像系統(tǒng)中測定目的基因與β-actin的吸光度比值。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間均數(shù)檢驗(yàn)比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 大鼠一般情況的變化

    在造模過程中,空白對照組大鼠飲食攝入規(guī)律,皮毛色澤光亮,精神狀態(tài)佳,體重有所增加;模型組大鼠在每日乙醇灌胃后先出現(xiàn)精神亢進(jìn)、興奮,持續(xù)2 h后出現(xiàn)精神萎靡,持續(xù)2周左右,大鼠皮毛色澤變暗、干枯,精神狀態(tài)差,飲食減少,體重增加變緩,部分甚至出現(xiàn)體重下降;紅景天甙低劑量及高劑量給藥組大鼠一般情況均優(yōu)于模型組。

    2 大鼠肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果

    空白組大鼠肝細(xì)胞排列整齊,肝小葉結(jié)構(gòu)清楚;模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,肝細(xì)胞水腫,肝細(xì)胞胞漿疏松化,胞漿內(nèi)可見脂肪空泡變,肝竇明顯擴(kuò)張,匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤,部分肝小葉內(nèi)纖維組織增多,肝細(xì)胞出現(xiàn)點(diǎn)狀及灶性壞死;紅景天甙40 mg/kg給藥組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)比較規(guī)整,肝細(xì)胞水腫及胞漿疏松化明顯減輕,匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤減少,未見壞死肝細(xì)胞;紅景天甙20 mg/kg 給藥組可見肝小葉結(jié)構(gòu)輕微紊亂,炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。紅景天甙組大鼠肝細(xì)胞病變程度較模型組明顯減輕,見圖1。

    Figure 1. The pathological changes of the liver tissues with HE staining (×200).

    圖1各組大鼠肝臟病理學(xué)變化

    3 各組大鼠血清指標(biāo)比較

    模型組的TG、ALT及AST水平均明顯高于空白組(P<0.05);與模型組相比,紅景天甙高、低劑量組的TG、ALT和AST水平均顯著降低(P<0.05),見表1。

    表1 各組大鼠血清TG、ALT及AST水平的變化

    *P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsmodel group.

    4 各組大鼠肝組織MDA含量及SOD活性的比較

    模型組MDA含量明顯高于空白對照組(P<0.05),紅景天甙高、低劑量組肝組織勻漿中MDA含量均明顯低于模型組(P<0.05);模型組SOD活性明顯低于空白對照組(P<0.05),紅景天甙高、低劑量組肝組織勻漿中SOD活性均明顯高于模型組(P<0.05),見表2。

    5 各組大鼠血清TNF-α和NF-κB 含量的變化

    模型組TNF-α和NF-κB 含量明顯高于空白對照組(P<0.05);紅景天甙高、低劑量組血清中TNF-α和NF-κB 含量均明顯低于模型組(P<0.05),見表3。

    表2各組大鼠肝組織MDA含量及SOD活性的變化

    Table 2. The effect of salidroside on the content of MDA and activity of SOD in rat liver tissues (Mean±SD.n=20)

    GroupMDA(μmol/gprotein)SOD(×103U/gprotein) Control0.81±0.16214.85±60.21 Bifendate0.87±0.44196.96±60.28 Model1.86±0.14?114.98±65.28? High?dosesalidroside0.86±0.14△200.38±76.02△ Low?dosesalidroside0.91±0.12△186.38±54.02△

    *P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsmodel group.

    表3各組大鼠血清TNFα和NF-κB含量的變化

    Table 3. The effect of salidroside on the serum levels of TNF-α and NF-κB in rats (Mean±SD.n=20)

    GroupTNF?α(ng/L)NF?κB(ng/L) Control112.81±15.16140.46±12.22 Bifendate128.57±18.24154.53±14.27 Model158.46±20.14?196.78±16.23? High?dosesalidroside116.67±18.13△152.50±15.19△ Low?dosesalidroside126.91±16.12△164.54±13.18△

    *P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsmodel group.

    6 Western blot結(jié)果

    對照組TNF-α和NF-κB 蛋白呈低表達(dá);模型組TNF-α和NF-κB蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05);紅景天甙高、低劑量組及陽性藥物對照組TNF-α和NF-κB蛋白表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.05),見圖2、表4。

    7 RT-PCR結(jié)果

    對照組TNF-α和NF-κB mRNA呈低表達(dá);模型組TNF-α和NF-κB的mRNA表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05);紅景天甙高、低劑量組及陽性藥物對照組TNF-α和NF-κB的mRNA表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.05),高劑量紅景天甙組最為顯著,見圖3、表5。

    Figure 2. The protein expression of TNF-α and NF-κB in rat liver tissues detected by Western blot.

    圖2各組大鼠肝組織TNF-α及NF-κB的蛋白表達(dá)情況

    表4各組大鼠肝組織TNF-α和NF-κB的蛋白表達(dá)

    Table 4. The protein expression of TNF-α and NF-κB in rat liver tissues detected by Western blot (Mean±SD.n=20)

    GroupTNF?αNF?κB Control0.10±0.010.15±0.02 Model0.51±0.04?0.74±0.06? Bifendate0.39±0.040.41±0.05 High?dosesalidroside0.18±0.02△0.32±0.01△ Low?dosesalidroside0.26±0.03△0.36±0.03△

    *P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsmodel group.

    Figure 3. The mRNA expression of TNF-α和NF-κB in rat liver tissues detected by RT-PCR.

    圖3各組大鼠肝組織TNF-α及NF-κB的mRNA表達(dá)情況

    討 論

    酒精性肝病(alcoholic liver diseases)是由于長期大量飲酒后乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛引起的肝臟內(nèi)環(huán)境及代謝紊亂的慢性肝病。疾病初期表現(xiàn)為脂肪肝,隨著病程進(jìn)展可發(fā)展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化及酒精性肝硬化,部分可發(fā)展至肝癌[5]。隨著人們生活水平的提高,酒精消費(fèi)人群在我國逐年上升,因酒精所誘發(fā)的疾病呈年輕化趨勢。因此,酒精性肝病的防治成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究表明,乙醇在肝細(xì)胞微粒體代謝過程中產(chǎn)生大量乙醛,乙醛具有明顯的細(xì)胞毒性作用,這種毒性作用可以抑制SOD抗氧化功能,從而使脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量升高,氧自由基大量蓄積導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)[6],同時(shí)乙醛影響大鼠肝組織脂質(zhì)代謝,使脂肪酸氧化減弱和三羧酸循環(huán)障礙,導(dǎo)致高脂血癥和脂肪肝[7]。

    表5各組大鼠肝組織TNF-α和NF-κB的mRNA表達(dá)

    Table 5. The mRNA expression of TNF-α and NF-κB in rat liver tissues detected by RT-PCR (Mean±SD.n=20)

    GroupTNF?α/β?actinNF?κB/β?actin Control0.46±0.130.40±0.16 Model1.66±0.12?1.72±0.13? Bifendate0.67±0.240.62±0.26 High?dosesalidroside0.58±0.16△0.52±0.16△ Low?dosesalidroside0.62±0.14△0.54±0.14△

    *P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsmodel group.

    乙醇灌胃為誘導(dǎo)酒精性肝損傷動物模型的常用方法[8],本實(shí)驗(yàn)通過乙醇灌胃誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷模型,進(jìn)一步探討紅景天甙的護(hù)肝作用及機(jī)制。灌胃乙醇4周后病理結(jié)果提示肝細(xì)胞不同程度受損,表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞脂肪變性、凋亡及壞死,血清ALT和AST活性顯著升高,AST水平高于ALT,肝勻漿中MDA含量升高且SOD活力降低,肝臟出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變,表明本實(shí)驗(yàn)動物模型成功制備。

    正常情況下,血清中ALT和AST含量甚少,當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí),存在于肝細(xì)胞胞漿及線粒體中的轉(zhuǎn)氨酶就會顯著升高并釋放到血液中,血清轉(zhuǎn)氨酶水平是肝臟損傷的敏感指標(biāo),其活性升高一定程度可反映肝臟受損傷的程度[9]。本研究表明紅景天甙各劑量組大鼠血清ALT及AST水平顯著降低,表明,紅景天甙具有一定的護(hù)肝作用。

    在生理情況下,體內(nèi)氧自由基生成與清除保持一定的平衡。SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì),能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì),是機(jī)體抗氧化平衡的重要指標(biāo)。當(dāng)體內(nèi)生成大量氧自由基時(shí),其攻擊細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸,從而使脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量升高,MDA可與生物分子結(jié)合形成復(fù)合物破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定,是細(xì)胞氧化損傷的重要指標(biāo)。長期慢性肝臟酒精代謝造成肝細(xì)胞氧化損傷,導(dǎo)致肝臟血脂代謝異常,血清中TG含量升高。因此血清中TG水平的變化也可間接反映酒精性肝損傷的程度[10]。本實(shí)驗(yàn)中,模型組抗氧化酶SOD活力下降,脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量升高,血清TG含量升高,表明酒精引起肝損傷與體內(nèi)氧化與抗氧化失衡有關(guān)。紅景天甙各劑量組結(jié)果表明,紅景天甙能夠增強(qiáng)機(jī)體抗氧化清除氧自由基的能力,使肝臟脂代謝穩(wěn)定,防止過度脂質(zhì)過氧化,紅景天甙高劑量組修復(fù)作用最為顯著,且HE染色結(jié)果同時(shí)證實(shí),紅景天甙治療組與模型組相比,肝細(xì)胞形態(tài)及肝小葉結(jié)構(gòu)均得到改善,與陽性對照藥聯(lián)苯雙酯滴丸療效相近,說明紅景天甙具有護(hù)肝作用。

    研究表明,激活的 Kupffer 細(xì)胞產(chǎn)生的 IL-6、IL-1β及TNF-α 等與酒精性肝損傷及其損傷程度高度相關(guān)[11-12]。NF-κB信號通路是介導(dǎo)各種細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的重要途徑之一。為了進(jìn)一步研究紅景天甙護(hù)肝作用的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA法測定各組大鼠血清中TNF-α和NF-κB的含量,Western blot 測定肝組織TNF-α和NF-κB的蛋白表達(dá)變化, RT-PCR測定其mRNA表達(dá)變化。酒精可激活Kupffer 細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子,其中TNF-α 是肝臟炎癥反應(yīng)重要的細(xì)胞因子。在生理情況下TNF-α具有促進(jìn)肝臟再生的功能,但是在酒精性肝損傷的發(fā)病過程中TNF-α的保護(hù)功能被逆轉(zhuǎn),反而加重肝臟損傷[13]。TNF-α 可活化NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、調(diào)控細(xì)胞凋亡及免疫介導(dǎo)等方面發(fā)揮作用[14]。在生理狀態(tài),NF-κB與抑制性IκB結(jié)合,呈二聚體形式,處于失活狀態(tài);在病理狀態(tài)下,NF-κB活化后與IκB解離,并進(jìn)入細(xì)胞核中,與特定的靶基因結(jié)合調(diào)控相應(yīng)的炎癥因子,增強(qiáng)TNF-α的基因轉(zhuǎn)錄,炎癥反應(yīng)逐級放大。在本實(shí)驗(yàn)中,模型組TNF-α及NF-κB含量均明顯升高,給予不同劑量紅景天甙處理后,炎癥指標(biāo)明顯下降,炎癥反應(yīng)減輕。

    通過上述研究得出,紅景天甙能夠改善酒精性肝損傷的病理學(xué)改變,一方面降低肝酶學(xué)指標(biāo),提高抗氧化酶SOD活性,抑制脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA產(chǎn)生;另一方面降低炎癥因子TNF-α及NF-κB含量表達(dá),減輕肝臟損傷程度。因此,紅景天甙可能通過NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減少活性氧自由基生成,抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng),減輕炎癥反應(yīng)達(dá)到保護(hù)肝臟的功能。

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