Jagged1調(diào)控STAT3信號(hào)通路影響多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡*

張熙輝， 龔 健， 黃 勝, 周 理， 徐明奎， 曾德斌

(1海南省中醫(yī)院骨二科， 海南 ?？?570203； 2唐山市第二醫(yī)院老年骨科， 河北 唐山 063000；3海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科， 海南 ?？?570102； 4海南省人民醫(yī)院顯微手外科， 海南 ?？?570311)

多發(fā)性骨髓瘤屬于惡性腫瘤，起源于骨髓中的漿細(xì)胞，骨骼變形、病理性骨折、貧血、出血和腎功能損害等是其主要的臨床癥狀，發(fā)病率約為2～3/10萬，40歲以上特別是60歲以上的老人是該病的高發(fā)人群，其發(fā)病率在血液腫瘤中位居第2位[1-2]。Jagged1是NOTCH的配體，也是在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)NOTCH的配體，在腎臟、胰腺和胎盤等多種組織中廣泛存在，在造血前體細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞等生長(zhǎng)中均具有調(diào)控作用[3-4]。研究顯示，Jagged1作為NOTCH信號(hào)通路的配體，可以調(diào)控NOTCH的激活影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，與腫瘤轉(zhuǎn)移、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和血管生成等均有密切關(guān)系，其在腦膠質(zhì)瘤、肝癌和乳腺癌等腫瘤中表達(dá)異常升高，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號(hào)通路作為腫瘤發(fā)生的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否與Jagged1有潛在聯(lián)系，尚不十分清楚[5-9]。本研究主要探討Jagged1對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響，以及其是否可以通過調(diào)控STAT3信號(hào)通路影響細(xì)胞凋亡，為研究Jagged1在腫瘤發(fā)生中的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266購自Saierbio；Jagged1小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)和siRNA陰性對(duì)照(siRNA negative control,siRNA-NC)購自Santa Cruz；青、鏈霉素購自Solarbio；cDNA合成試劑盒購自TIANGEN；STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490購自Tocris；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)和Jagged1引物由上海生工生物合成；SYBR熒光定量PCR試劑盒購自Roche；Lipofectamine 2000購自Invitrogen；RNA提取試劑盒購自Sigma；抗STAT3、p-STAT3和Bax抗體均購自Santa Cruz；膜聯(lián)蛋白 V(Annexin V)-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海生工；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購自TIANGEN。

2 方法

2.1細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 U266細(xì)胞種植到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，觀察細(xì)胞融合度達(dá)到60%以后，把培養(yǎng)液吸除以后，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌2次，用不含血清的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育1 h。將Jagged1 siRNA和siRNA-NC用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染至U266細(xì)胞中，依次命名為Jagged1 si-RNA組和siRNA-NC組，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照 (control)組，細(xì)胞不做處理。培養(yǎng)48 h以后，用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞中的Jagged1水平。同時(shí)分別在0 h、24 h、48 h和72 h用臺(tái)盼藍(lán)染色，繪制各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。U266細(xì)胞用含有10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

2.2RT-qPCR檢測(cè)Jagged1的mRNA水平 Control組、siRNA-NC組和Jagged1 siRNA組細(xì)胞按照2.1中方法處理后培養(yǎng)48 h，加入1 mL的TRIzol溶液(1×106個(gè)細(xì)胞中加1 mL)，吹打混合5 min，在室溫條件下靜置5 min。在裂解液中加入200 μL的氯仿，劇烈混合30 s，在室溫條件下靜置5 min，在4 ℃、14 000×g離心15 min，此時(shí)溶液分為3層，將上層水相層溶液吸取到EP管中，加入500 μL的異丙醇，上下顛倒混合后，4 ℃、14 000×g離心15 min，將上清液吸除后，用與TRIzol裂解液同等體積的乙醇洗滌2次，4 ℃、10 000×g離心15 min，用移液器把上清吸除以后，放在室溫中干燥后，用DEPC水20 μL溶解RNA。以分光光度計(jì)法檢測(cè)RNA的濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SYBR熒光定量PCR檢測(cè)Jagged1水平，內(nèi)參照為β-actin。β-actin的上游引物序列為 5’-GGAAATCGTGCGTGACAT-3’，下游引物序列為5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’；Jagged1的上游引物序列為5’-AAGTGTGCCTCAAGGAGTATC’-3， 下游引物序列為 5’-ACTGTCAGGTTGAACGGTGTC-3’。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.3Western blot檢測(cè)Jagged1的蛋白水平 Control組、siRNA-NC組和Jagged1 siRNA組細(xì)胞按照2.1中方法處理后，培養(yǎng)48 h，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，放在冰上裂解20 min，4 ℃、14 000×g離心20 min，吸取蛋白上清，保存在-80 ℃。BCA法檢測(cè)蛋白濃度，用12%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行電泳。蛋白樣品變性(100 ℃煮沸5 min)處理后，每孔加入40 μg進(jìn)行電泳，先用80 V恒壓電泳，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠的邊緣時(shí)，改成90 V，直到溴酚藍(lán)完全跑出凝膠。200 mA，轉(zhuǎn)膜2 h。5%牛血清白蛋白室溫封閉1.5 h。將膜放在1 ∶800稀釋的抗Jagged1抗體中，4 ℃結(jié)合過夜。TBST洗膜3次。把膜放在1∶2 000稀釋的II 抗中，室溫孵育1.5 h。ECL發(fā)光后，掃描圖像，分析蛋白水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.4細(xì)胞活力的檢測(cè) 各組細(xì)胞按照2.1中方法處理后，將細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)組設(shè)置8個(gè)平行孔，放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，在每個(gè)孔中加入5 μL的MTT溶液，孵育4 h以后，把MTT溶液棄掉，每孔中加入200 μL的二甲基亞砜溶液，孵育10 min后，全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.5細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 各組細(xì)胞按照2.1中方法處理后，培養(yǎng)72 h，收集各組細(xì)胞，用5 μL的PI和10 μL的Annexin V-FITC，室溫孵育15 min，再加入300 μL的結(jié)合緩沖液，混合后，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。同時(shí)用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中STAT3、p-STAT3和Bax水平，步驟同2.3。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2.6抑制STAT3信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡影響 Control組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入40 μmol/L的AG490，記為AG490組，Western blot檢測(cè)control組和AG490組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞中STAT3和p-STAT3水平，步驟同2.3。 用40 μmol/L的AG490處理Jagged1 siRNA組細(xì)胞，記為AG490+Jagged1 siRNA組，培養(yǎng)72 h，MTT檢測(cè)AG490組、AG490+Jagged1 siRNA組和Jagged1 siRNA組細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AG490、AG490+Jagged1 siRNA和Jagged1 siRNA各組細(xì)胞的凋亡情況，步驟同2.4和2.5。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Jagged1水平下調(diào)

Control組、siRNA-NC組和Jagged1 siRNA組細(xì)胞中Jagged1 mRNA水平和蛋白水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Jagged1 siRNA組細(xì)胞Jagged1的mRNA和蛋白水平均明顯低于control組(P<0.05)，而siRNA-NC組細(xì)胞Jagged1的mRNA和蛋白水平與control組相比沒有明顯變化，說明Jagged1 siRNA抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中Jagged1的表達(dá)，見圖1。

Figure 1. The expression of Jagged1 at mRNA (A) and protein (B) levels in the cells after transfection.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC group.

圖1轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中Jagged1mRNA和蛋白水平

2 敲減Jagged1表達(dá)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)

如圖2所示，siRNA-NC組在24 h、48 h和72 h的細(xì)胞數(shù)目與control組相比沒有明顯變化；Jagged1 siRNA組在24 h、48 h和72 h的細(xì)胞數(shù)目與control組相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明敲減Jagged1表達(dá)抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

Figure 2. The cell growth curves determined by the method of Trypan blue exclusion. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC group.

圖2臺(tái)盼藍(lán)染色繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

3 敲減Jagged1表達(dá)抑制細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

如圖3所示，Jagged1 siRNA組細(xì)胞的凋亡率明顯高于control組，而細(xì)胞活力明顯低于control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而siRNA-NC組細(xì)胞的凋亡率和活力與control組相比沒有明顯變化， 說明敲減Jagged1表達(dá)抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

4 敲減Jagged1表達(dá)對(duì)STAT3、p-STAT3和Bax蛋白水平的影響

如圖4所示，control、siRNA-NC和Jagged1 si-RNA 3組細(xì)胞p-STAT3/STAT3水平和Bax/β-actin水平的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Jagged1 siRNA組細(xì)胞的p-STAT3/STAT3蛋白水平明顯低于control組，而Bax/β-actin水平明顯高于control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，siRNA-NC組細(xì)胞的p-STAT3/STAT3和Bax/β-actin水平與control組相比沒有明顯變化，說明敲減Jagged1表達(dá)抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路激活，促進(jìn)Bax表達(dá)。

5 AG490降低細(xì)胞中p-STAT3的水平

如圖5所示,AG490組的p-STAT3/STAT3水平明顯低于control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明AG490抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路激活，降低STAT3的磷酸化水平。

Figure 3. Knockdown ofJagged1 expression promoted apoptosis and inhibited cell viability. A: the images of flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining for analysis of apoptosis; B: the quantitative analysis of cell apoptotic rate; C: theAvalue of MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC group.

圖3敲減Jagged1表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞活力

Figure 4. Knockdown ofJagged1 expression inhibited the activation of STAT3 signaling pathway in multiple myeloma cells and promoted the expression of Bax. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC group.

圖4敲降Jagged1表達(dá)抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路激活，促進(jìn)Bax表達(dá)

Figure 5. AG490 inhibited the activation of the STAT3 signaling in the cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5AG490抑制細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路的激活

6 AG490對(duì)細(xì)胞活力和凋亡的影響

如圖6所示，AG490、Jagged1 siRNA和AG490+Jagged1 siRNA 3組細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞活力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； AG490+Jagged1 si-RNA組的凋亡率明顯高于Jagged1 siRNA組和AG490組，而細(xì)胞活力明顯低于Jagged1 siRNA組和AG490組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明STAT3信號(hào)通路抑制劑可提高細(xì)胞凋亡率，降低細(xì)胞活力， STAT3信號(hào)通路抑制劑與下調(diào)Jagged1具有協(xié)同作用。

Figure 6. The inhibitory effects of STAT3 signaling inhibitor AG490 on the cell viability and apoptosis. A: the images of flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining for analysis of cell apoptosis; B: the quantitative analysis of the apoptotic rate; C: theAvalue of MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsJagged1 siRNA group and AG490 group.

圖6抑制STAT3信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的影響

討 論

人類的Jagged1基因定位在20p12染色體上，全長(zhǎng)5 940 bp，其開放閱讀框編碼3 657個(gè)氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)可以通過與NOTCH相互作用，進(jìn)入細(xì)胞核，影響下游靶基因的激活[10-11]。Jagged1參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，在間變性大細(xì)胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤等腫瘤過度激活，后續(xù)報(bào)道顯示，在急性髓性白血病、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌和前列腺癌等腫瘤同樣發(fā)現(xiàn)Jagged1表達(dá)上調(diào)[12-15]。研究顯示，Jagged1表達(dá)下調(diào)后的前列腺癌細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞生長(zhǎng)受阻，并且其在前列腺癌中的表達(dá)水平與前列腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等正相關(guān)[16-17]。本研究結(jié)果顯示，Jagged1表達(dá)下調(diào)后的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度降低，細(xì)胞活力下降，說明Jagged1下調(diào)后能夠抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，在腫瘤中發(fā)揮癌基因的作用。

腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)是一個(gè)復(fù)雜過程，是一系列癌基因以及抑癌基因共同作用的結(jié)果。正常細(xì)胞的增殖和凋亡是一種動(dòng)態(tài)平衡過程，在受到病理因素的刺激后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，凋亡減少，細(xì)胞發(fā)生癌變，導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生[18]。細(xì)胞凋亡的機(jī)制較為復(fù)雜，其中Bcl-2蛋白家族與細(xì)胞凋亡有關(guān)，根據(jù)在細(xì)胞凋亡中的作用不同其蛋白成員可以分為促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，Bax是Bcl-2蛋白家族成員之一，是一種重要的促凋亡蛋白[19-22]。姜黃素和三七皂苷等抗腫瘤藥物及腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 (TNF receptor-associated factor 6, TRAF6)等癌基因都可以通過促進(jìn)Bax的表達(dá)調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡[23-25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲減Jagged1表達(dá)后的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中Bax水平升高，細(xì)胞凋亡率也升高，說明下調(diào)Jagged1促進(jìn)Bax表達(dá)，誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡。

STAT3參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡等過程，不僅在組織器官正常功能維持等方面具有重要作用，在動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥和缺血再灌注等疾病發(fā)生中也具有調(diào)控作用[26]。近年來的研究顯示，STAT3在骨髓瘤、膠質(zhì)瘤和胰腺癌等組織中過度激活，STAT3磷酸化水平異常升高，而通過抑制STAT3信號(hào)通路后，白血病細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞生長(zhǎng)受阻[27-29]。Chen等[30]在研究血管細(xì)胞分化中發(fā)現(xiàn)，microRNA-199b可以通過影響Jagged1的表達(dá)，調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的水平，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平與STAT3的激活有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)表明，敲減Jagged1表達(dá)后的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中STAT3磷酸化水平降低，STAT3信號(hào)通路受阻，而用STAT3信號(hào)通路抑制劑處理后，敲減Jagged1表達(dá)的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高，細(xì)胞活力進(jìn)一步下降，下調(diào)Jagged1表達(dá)可以抑制STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡。

綜上所述，下調(diào)Jagged1表達(dá)通過抑制STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。Jagged1是治多發(fā)性骨髓瘤的潛在靶點(diǎn)，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)在多株多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證；而其對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)等的作用尚不清楚，在以后實(shí)驗(yàn)中會(huì)繼續(xù)探討。