紫草素對高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡和氧化應激的影響

王喜歡， 張金華， 胡亞南， 張 洪

(南陽市第二人民醫(yī)院心血管內(nèi)科， 河南 南陽 473000)

血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cells,VECs)是被覆于血管內(nèi)膜的一群細胞，代謝活躍且可合成及分泌大量的血管活性物質(zhì)，對維持血管正常生理功能具有重要作用[1]。研究顯示，在糖尿病血管并發(fā)癥中均涉及到血管內(nèi)皮的損傷及功能障礙，且這種損傷可進一步誘發(fā)和加重其它急性心血管疾病的風險[1-3]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，急、慢性的高糖狀態(tài)可抑制血管內(nèi)皮細胞生長，并誘發(fā)內(nèi)皮細胞的凋亡，繼發(fā)血管內(nèi)皮損傷[4]。但是，關于高糖誘發(fā)內(nèi)皮細胞凋亡的確切機制還不甚明了，多數(shù)研究認為，活性氧生成增加所致的氧化損傷和氧化應激反應是關鍵的因素之一[5]。故而維持內(nèi)皮細胞中氧化還原反應平衡對于保護血管內(nèi)皮具有重要的意義。紫草素(shikonin)是從紫草的根中提取的一種脂溶性萘醌類化合物，其藥理學作用研究表明，紫草素具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和抗腫瘤等作用，具有廣闊的臨床應用前景[6-8]。本研究以大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞為研究對象，評估紫草素對高糖誘導內(nèi)皮細胞凋亡的影響，并從氧化應激的角度初步探討其可能的作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

細胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基購自HyClone；紫草素購自Enzo Biochem，其化學結(jié)構(gòu)如圖1A所示；大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞為本實驗室自行凍存；抗cleaved caspase-3/caspase-3和β-actin抗體購自Cell Signaling Technololgy；抗Nrf2 (nuclear)、 Nrf2 (total)、 H3及HO-1抗體購自Santa Cruz； CCK-8細胞活力分析試劑盒購自廣州奕源公司；細胞核蛋白分離試劑盒、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所； 丙二醛(malondialdehyole, MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；流式細胞術凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司。

2 實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)、分組和干預 VECs用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、1%青霉素、1%鏈霉素及10 μg/L β-ECGF的DMEM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱，定期換液及傳代，保證細胞良好的生存狀態(tài)。將消化后的細胞接種至細胞培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁生長至約80%融合時，更換培養(yǎng)基對細胞做12 h的饑餓處理，而后加藥干預。細胞組別設置為：正常對照組(control組，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)、高糖組(Gh組，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為33 mmol/L)、高糖+低濃度紫草素組(GSl組，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為33 mmol/L，紫草素濃度為0.1 μmol/L)、高糖+中濃度紫草素組(GSm組，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為33 mmol/L，紫草素濃度為1 μmol/L)和高糖+高濃度紫草素組(GSh組，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為33 mmol/L，紫草素濃度為10 μmol/L)。

2.2CCK-8法測定細胞活力 將消化后的細胞按照每孔5×103個的密度接種至96孔板，經(jīng)相應的藥物干預后，在超凈臺中向每孔加入CCK-8試劑10 μL，重新放回CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。取出培養(yǎng)板用酶標儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度(A)值，計算細胞的相對活力。每組設置3個復孔取其均值，同時設只加入培養(yǎng)基的單孔作為空白對照。

2.3檢測MDA和ROS的含量及SOD和GSH-Px活性的變化以評價細胞氧化應激狀態(tài) 各項檢測均依據(jù)公司提供的試劑盒說明書進行操作。

2.4細胞凋亡檢測 本實驗采用流式細胞術Annexin V/PI雙染色法檢測細胞經(jīng)干預后的凋亡狀況。各組細胞消化后，用PBS漂洗2次，然后離心收集細胞，依據(jù)說明書要求加入Binding Buffer，而后室溫條件下加入Annexin V-FITC避光孵育10 min，最后避光條件下加入PI孵育5 min。流式細胞儀檢測各組的熒光強度并進行定量分析；檢測條件為 Ex=488 nm， Em=530 nm。

2.5Western blot 檢測蛋白水平 對于細胞核蛋白核Nrf2的測定，首先根據(jù)細胞核蛋白分離試劑盒說明書提取核蛋白；總蛋白的檢測直接進行RIPA裂解液收集細胞蛋白。對所提蛋白(包含分離的核蛋白和全蛋白)進行定量，然后依據(jù)定量結(jié)果調(diào)整蛋白上樣量(60 μg)后進行SDS-PAGE。待電泳結(jié)束，通過電轉(zhuǎn)的方法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。取出PVDF膜置于小盒子中，并在室溫條件下加入5%的脫脂牛奶封閉90 min，棄牛奶后按說明書要求的比例加入相應的 I 抗4 ℃孵育過夜，次日取出PVDF膜經(jīng)TBST洗滌3次，每次5 min；然后按說明書要求加入相對應的 II 抗室溫孵育2 h，經(jīng)TBST洗滌3次后于暗室中撒ECL發(fā)光液顯影，曝光并沖洗膠片。全蛋白以β-actin為內(nèi)參照，核蛋白以H3為內(nèi)參照。所得結(jié)果采用ImageJ進行灰度半定量分析。

3 統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)錄入SPSS 15.0軟件中進行統(tǒng)計學分析。實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間的比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 紫草素對高糖誘導的內(nèi)皮細胞凋亡的作用

CCK-8法細胞活力檢測的結(jié)果顯示，高濃度的葡萄糖可致使內(nèi)皮細胞活力降低，而同時給予不同濃度的紫草素(結(jié)構(gòu)式見圖1A)干預后，細胞活力有所回升，且紫草素濃度在1 μmol/L及10 μmol/L時的作用顯著，見圖1B。流式細胞術Annexin V/PI雙染法細胞凋亡檢測的結(jié)果顯示，高濃度葡萄糖處理內(nèi)皮細胞后，細胞的早期凋亡率顯著上升(P<0.05)；而加入1 μmol/L及10 μmol/L的紫草素干預后，細胞早期凋亡率分別降低(P<0.05)，見圖2A。Western blot檢測結(jié)果顯示，高濃度葡萄糖處理內(nèi)皮細胞后，caspase-3發(fā)生剪切，而加入1 μmol/L和10 μmol/L的紫草素干預后，cleaved caspase-3明顯減少(P<0.05)，見圖2B。以上結(jié)果提示紫草素可抑制高糖誘導的內(nèi)皮細胞凋亡。

2 紫草素對高糖誘導內(nèi)皮細胞氧化應激的影響

如圖3所示，Gh組的內(nèi)皮細胞經(jīng)高糖誘導后， MDA及ROS的含量顯著增加，同時胞內(nèi)SOD及GSH-Px的活性顯著降低(P<0.05)；而GSm組和GSh組的細胞分別經(jīng)1 μmol/L及10 μmol/L紫草素干預之后，MDA及ROS的含量相比于Gh組顯著降低， SOD及GSH-Px的活性相比于Gh組則顯著增加(P<0.05)。這些結(jié)果說明高糖可誘導內(nèi)皮細胞中氧化應激反應的發(fā)生，而紫草素可部分抑制該作用。

3 紫草素對高糖誘導內(nèi)皮細胞中Nrf2/HO-1信號通路活性的影響

Western blot檢測結(jié)果如圖4所示，Gh組的內(nèi)皮細胞經(jīng)高糖誘導后，HO-1及核內(nèi)Nrf2的蛋白水平增加，總Nrf2的蛋白表達未出現(xiàn)明顯變化；而GSh組的細胞經(jīng)10 μmol/L紫草素干預之后，HO-1和核內(nèi)Nrf2的蛋白水平相比于Gh組顯著降低，總Nrf2蛋白的水平?jīng)]明顯變化。這一結(jié)果說明紫草素可抑制內(nèi)皮細胞中抗氧化信號通路Nrf2/HO-1的激活，進而促進凋亡效應蛋白caspase-3的活化，維持胞內(nèi)氧化應激狀態(tài)的穩(wěn)定。

Figure 1. The effect of shikonin on the viability of VECs induced by high glucose. A: the structural formula of shikonin; B: the cell viability detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsGhgroup.

圖1紫草素對高糖誘導內(nèi)皮細胞活力的影響

討 論

紫草素是一種中草藥提取物，具有抗氧化應激和抗炎等廣泛的藥理活性。本研究以高糖刺激大鼠來源胸主動脈內(nèi)皮細胞誘導內(nèi)皮細胞損傷模型，而后在此基礎上研究紫草素對內(nèi)皮損傷的作用。結(jié)果顯示高糖刺激可顯著降低內(nèi)皮細胞活力，并誘導細胞凋亡；而經(jīng)紫草素干預后細胞凋亡率有所降低。結(jié)果提示紫草素可抑制高糖所誘導的內(nèi)皮細胞凋亡，具有一定保護血管內(nèi)皮的活性。

然后我們進一步研究了紫草素抑制高糖所致的內(nèi)皮細胞凋亡中可能涉及的作用機制。正常生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)存在多種抗氧化物質(zhì)，可及時清除細胞代謝過程中生成的各種活性氧，維持氧化還原反應的平衡[9]。一旦胞內(nèi)氧化產(chǎn)物如MDA及ROS聚集過多，超出了抗氧化系統(tǒng)(如SOD及GSH-Px)的調(diào)節(jié)范圍，即會導致胞內(nèi)氧化應激的產(chǎn)生，并進一步通過復雜的信號通路致使細胞凋亡[10-11]。早期的研究提示，高濃度的葡萄糖可刺激細胞內(nèi)活性氧的生成[12]。故而本研究檢測了內(nèi)皮細胞中的氧化應激狀態(tài)，結(jié)果顯示經(jīng)高糖誘導后，內(nèi)皮細胞中MDA及ROS的含量顯著增加，同時胞內(nèi)SOD及GSH-Px的活性顯著降低；加入紫草素干預則可下調(diào)胞內(nèi)MDA及ROS的含量，同時升高 SOD及GSH-Px的活性。結(jié)果表明高糖可誘導內(nèi)皮細胞中ROS的聚集及氧化應激反應的發(fā)生，而紫草素可部分抑制該作用；這可能是紫草素在高糖環(huán)境下保護血管內(nèi)皮的機制之一。

Figure 2. The effect of shikonin on the apoptosis of VECs induced by high glucose. A: the representative images of Annexin V/PI double staining by flow cytometry and statistical analysis of cell apoptosis; B: the representative images of Western blot and statistical analysis of cleaved caspase-3 protein levels. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsGhgroup.

圖2紫草素對高糖誘導內(nèi)皮細胞凋亡及凋亡蛋白的影響

細胞內(nèi)還存在應對氧化應激反應的防御機制， Nrf2就是其中之一。在氧化應激發(fā)生時，Nrf2活化后進入細胞核結(jié)合抗氧化原件，促進各種抗氧化酶及解毒酶的合成，去除過量的ROS，以抵抗氧化應激損傷[13-15]。HO-1即是Nrf2下游的一種血紅素降解限速酶，具有較強的自由基清除作用，可對抗氧化損傷[15-17]。故而本研究進一步檢測了在高糖誘導的內(nèi)皮細胞損傷中，Nrf2信號通路的狀態(tài)以及紫草素的作用。結(jié)果顯示，經(jīng)高糖誘導后內(nèi)皮細胞中HO-1及核內(nèi)Nrf2的蛋白表達增加，總Nrf2的蛋白表達未出現(xiàn)明顯變化；可能是高糖刺激活性氧的生成激活了細胞內(nèi)的自我保護機制，通過促進胞內(nèi)Nrf2的核轉(zhuǎn)位以及下游HO-1的表達來降低氧化應激所致的損傷。而內(nèi)皮細胞經(jīng)10 μmol/L紫草素干預后，HO-1和核內(nèi)Nrf2蛋白表達水平顯著降低。這提示紫草素可降低核內(nèi)Nrf2的表達，其減輕高糖所致的氧化損傷的作用可能與Nrf2/HO-1信號通路密切相關。

Figure 3. The effect of shikonin on the status of oxidative stress in VECs induced by high glucose. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsGhgroup.

圖3Shikonin對高糖誘導內(nèi)皮細胞氧化應激的影響

Figure 4. The effect of shikonin on the activation of Nrf2/HO-1 pathway in VECs induced by high glucose. A: the representative images of Western blot and statistical analysis of nuclear (N) and total (T) Nrf2 expression; B: the representative images of Western blot and statistical analysis of HO-1 expression. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsGhgroup.

圖4Shikonin對高糖誘導內(nèi)皮細胞Nrf2/HO-1信號通路活性的影響

綜上所述，紫草素可顯著抑制高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡，并通過下調(diào)核Nrf2轉(zhuǎn)位和 HO-1的表達，以抵抗高糖誘導的內(nèi)皮細胞氧化應激損傷，對細胞產(chǎn)生保護作用。