Zacopride對(duì)血管緊張素Ⅱ誘發(fā)的心肌纖維化的影響*

張 研， 張海楠， 許 靜， 呂藝蓁， 張 瑾， 彭 菁，李 盼， 喬 希， 劉清華， 4△

(山西醫(yī)科大學(xué) 1病理生理教研室， 2第一臨床醫(yī)學(xué)院， 3公共衛(wèi)生學(xué)院，4細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山西 太原 030001)

心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFb)是心肌間質(zhì)主要細(xì)胞成分，占心臟細(xì)胞總數(shù)70%，在維持心臟正常結(jié)構(gòu)和功能方面起重要作用[1-2]。心臟成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成在心肌纖維化中具有至關(guān)重要的作用，是病理性心肌纖維化和心室重構(gòu)的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子[3]。在高血壓性心臟病、缺血性心肌病、冠心病和心力衰竭等心血管疾病中心肌纖維化是心肌重構(gòu)發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一[4]。除了積極治療原發(fā)病，抗纖維化治療也是不容忽視的重要策略。因此，揭示心室重構(gòu)及心衰產(chǎn)生的分子機(jī)制，有效預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，成為諸多心血管疾病的研究和防治的重要目標(biāo)。

心室成纖維細(xì)胞增殖及間質(zhì)纖維化可造成心室壁僵硬，順應(yīng)性降低，舒縮功能障礙。除此之外，心肌纖維化還可導(dǎo)致心臟電生理重構(gòu)，誘導(dǎo)室性心律失常的發(fā)生[5]。既往關(guān)于電生理重構(gòu)的研究大多集中在心肌細(xì)胞的離子通道[6]，而對(duì)成纖維細(xì)胞離子通道在心肌纖維化的發(fā)生與發(fā)展中的作用了解甚少，有待進(jìn)一步研究。心臟成纖維細(xì)胞沒(méi)有電興奮，但是它們能夠極化靜息膜電位(resting membrane potential，RMP)[7]。已知在人和大鼠心臟成纖維細(xì)胞膜上，表達(dá)廣泛的離子通道[8-9]，其中內(nèi)向整流鉀通道(inwardly rectifying potassuim channels，IK1，IKir)主要決定成纖維細(xì)胞靜息膜電位。本課題組發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了首個(gè)IK1選擇性激動(dòng)劑扎考必利(zacopride，Zac)[10]，它可通過(guò)特異性增強(qiáng)大鼠心室肌IK1改善異丙腎上腺素誘發(fā)的心室重構(gòu)[11]。此外,Zac不僅可以逆轉(zhuǎn)心室肌肥厚，還可以拮抗心肌纖維化。Kir2.1是心臟成纖維細(xì)胞IK1通道的主要亞單位，我們已證明Zac激動(dòng)IK1的有效靶點(diǎn)就是Kir2.1 的同源聚合體[12]，提示Zac也可能通過(guò)改變心室成纖維細(xì)胞IK1而改變間質(zhì)重構(gòu)。本研究將在細(xì)胞水平模擬心肌纖維化，以血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞活化和膠原表達(dá)模型為對(duì)象，觀察Zac對(duì)成纖維細(xì)胞IK1通道表達(dá)及細(xì)胞活力和凋亡的影響，探討Zac抑制心室間質(zhì)纖維化可能的機(jī)制，從而為抗心室重構(gòu)治療尋找新的藥物作用靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

新生1～3 d的SD乳鼠，雌雄不限，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SYXK(晉)2015-0001。

2 主要試劑

Zacopride和Ang Ⅱ 購(gòu)自Tocris；氯喹(chloroquine,Chlo)、卡托普利(captopril,Cap)和小鼠抗Kir2.1單克隆抗體購(gòu)自Sigma；兔抗GAPDH單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；DMEM培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素購(gòu)自HyClone；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶購(gòu)自Gibco；其余均為國(guó)內(nèi)生產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

3 主要方法

3.1乳鼠心室成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng) 取20 只1～3 d新生乳鼠，用75% 乙醇浸泡消毒。在無(wú)菌條件下用彎剪剪開(kāi)胸壁立即取出心臟，并放入冰冷的PBS液中，切取心室，初步洗去心室內(nèi)的血液后，轉(zhuǎn)移入EP管中，剪成(1～3) mm×1 mm×1 mm的碎塊，靜置5 min后，棄上清以去除紅細(xì)胞。采用0.08% 胰酶和0.04%Ⅱ型膠原酶(現(xiàn)用現(xiàn)配，混合比例為1 ∶2)，進(jìn)行多次消化，每次37 ℃，消化6～8 min，吸取上層的細(xì)胞懸液，加入到50 mL離心管(預(yù)先加入25 mL含15% FBS的DMEM培養(yǎng)基)中，終止胰酶作用，重復(fù)消化直至組織塊消化干凈。收集的細(xì)胞懸液800 r/min離心10 min，重懸后200 目濾網(wǎng)過(guò)濾，所得細(xì)胞培養(yǎng)48 h以使成纖維細(xì)胞貼壁，棄去未貼壁的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)在含15% FBS的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，用0.25% 胰酶消化傳代，實(shí)驗(yàn)取傳代2～4代細(xì)胞。原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞隨機(jī)分成6組：正常對(duì)照(control)組、Ang Ⅱ(1 μmol/L)組、Ang Ⅱ+Zac (1 μmol/L)組、Ang Ⅱ+Zac+BaCl2(1 μmol/L)組、Ang Ⅱ+Zac+Chlo (0.3 μmol/L)組和Ang Ⅱ+Cap (10 μmol/L)組，各組細(xì)胞分別加藥處理后，培養(yǎng)24 h，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

3.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 在96 孔板中配置100 μL的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在37 ℃、5% CO2條件的培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h。按上述分組向培養(yǎng)板加入不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24 h。向每孔加入10 μL CCK-8檢測(cè)液，將培養(yǎng)板在敷箱中孵育2～4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(A)值。

3.3ELISA法檢測(cè)Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量 取第3 代CFb制成細(xì)胞懸液，以2.5×108/L的細(xì)胞濃度接種于24 孔板，每孔 1 mL。各因素處理后，分別在培養(yǎng)的 48 h后離心吸取細(xì)胞上清液按照ELISA 試劑盒說(shuō)明檢測(cè)Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的含量。

3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率 各組細(xì)胞加藥培養(yǎng)24 h后，用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化細(xì)胞，收集細(xì)胞并制成1×108/L的細(xì)胞懸液，800 r/min離心10 min，棄上清液，PBS 洗滌樣品細(xì)胞，過(guò)濾，離心，棄上清。根據(jù)AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)記試劑盒說(shuō)明加入染料，避光30 min，上機(jī)檢測(cè)。

3.5Western blot 法檢測(cè)蛋白的表達(dá) 提取各組心臟成纖維細(xì)胞在冰上加入裂解液，超聲破碎細(xì)胞，利用Eppendorf進(jìn)一步勻漿(12 000 r/min，30 min，4 ℃)。抽取上清液進(jìn)行分裝。用Bradford比色法測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算上樣量，配置12.5%分離膠和5 %濃縮膠上樣后進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，室溫封閉2 h后加入Ⅰ 抗(Kir2.1抗體稀釋1.5 ∶1 000；GAPDH抗體稀釋1 ∶5 000)，4 ℃ 過(guò)夜。TBST清洗3次，每次10 min，后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，再次清洗3次，每次10 min?；瘜W(xué)增強(qiáng)發(fā)光試劑反應(yīng)，壓片曝光，放入顯影液、定影液，結(jié)果采用ImageJ圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行處理分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，采用SPSS 17. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

在倒置顯微鏡下可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，分離和培養(yǎng)的乳鼠心臟成纖維細(xì)胞，經(jīng)1 μmol/L的Ang Ⅱ 孵育24 h后細(xì)胞顯著增殖，生長(zhǎng)密集，呈火焰狀；Zac組細(xì)胞數(shù)量減少，表明Zac可抑制其增殖，并且與Ang Ⅱ+Cap組無(wú)明顯差異；分別用IK1的相對(duì)特異性阻斷劑BaCl2和Chlo均可以逆轉(zhuǎn)其效應(yīng)；表明Zac可顯著降低Ang Ⅱ誘發(fā)的心臟成纖維細(xì)胞增殖,見(jiàn)圖1。

2 Zac對(duì)心臟成纖維細(xì)胞活力的影響

CCK-8 比色法檢測(cè)不同藥物干預(yù)心臟成纖維細(xì)胞24 h 后各組細(xì)胞活力的變化。如圖2 所示，心臟成纖維細(xì)胞給予Ang Ⅱ 處理24 h 后，與對(duì)照組相比A值顯著增加，Zac處理后可顯著抑制其上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；用IK1阻斷劑BaCl2和Chlo后，A值降低，說(shuō)明Zac對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFs 活力有抑制作用。

3 Zac對(duì)心臟成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量的影響

各處理因素作用24 h后，Ang Ⅱ模型組細(xì)胞Ⅰ 型膠原和Ⅲ型膠原含量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；Zac可抑制Ang Ⅱ 誘導(dǎo)的膠原合成增加(P<0.05)；適當(dāng)劑量氯喹和BaCl2選擇性阻斷IK1可消除Zac 的作用，見(jiàn)圖3。

Figure 1. The effect of Zac on the morphological changes of the neonatal rat cardiac fibroblasts observed under microscope (×200).

圖1Zac對(duì)乳鼠心臟成纖維細(xì)胞形態(tài)的影響

Figure 2. The changes of the viability of AngⅡ-treated cardiac fibroblasts detected by CCK-8 assay. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡ group;△P<0.05vsAngⅡ+Zac group.

圖2Zac對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的CFb活力的影響

4 Zac對(duì)心臟成纖維細(xì)胞凋亡的影響

乳鼠心肌成纖維細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和Ang Ⅱ組相比，Zac干預(yù)后明顯增加成纖維細(xì)胞的凋亡(P<0.05);運(yùn)用BaCl2和Chlo可阻斷Zac的效應(yīng)，說(shuō)明Zac促成纖維細(xì)胞凋亡是通過(guò)特異性激動(dòng)IK1介導(dǎo)的，促凋亡可能是其發(fā)揮抗心肌纖維化的重要機(jī)制，見(jiàn)圖4。

Figure 3. The effects of Zac on secretion of type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen in the cardiac fibroblasts. Mean±SEM.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng Ⅱ group;△P<0.05vsAng Ⅱ+ Zac group.

圖3Zac對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞膠原合成的影響

Figure 4. Zac promoted the apoptosis of cardiac fibroblasts in neonatal rats. Mean±SEM.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng Ⅱ group;△P<0.05vsAngⅡ+Zac group.

圖4Zac可促進(jìn)乳鼠心臟成纖維細(xì)胞凋亡

5 Zac對(duì)Kir2.1通道蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，血管緊張素Ⅱ可明顯抑制Kir2.1表達(dá)，Zac干預(yù)后可使Kir2.1表達(dá)增加(P<0.05);BaCl2和Chlo可阻斷Zac的上述效應(yīng)，說(shuō)明Zac抑制心肌纖維化可能是通過(guò)選擇性激動(dòng)IK1通道介導(dǎo)的?？ㄍ衅绽⒉荒茉鰪?qiáng)AngⅡ處理后成纖維細(xì)胞中Kir2.1表達(dá)，提示其抗纖維化效應(yīng)不是通過(guò)IK1通道介導(dǎo)的。

Figure 5. The effects of Zac on the protein expression of Kir2.1 in neonatal rat cardiac fibroblasts treated with Ang Ⅱ. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng Ⅱ group;△P<0.05 Ang Ⅱ+Zac group.

圖5Zac對(duì)AngⅡ孵育乳鼠心臟成纖維細(xì)胞Kir2.1蛋白表達(dá)的影響

討 論

心室重構(gòu)不僅表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的變化，同樣還表現(xiàn)為間質(zhì)細(xì)胞的變化。心肌間質(zhì)主要是由成纖維細(xì)胞分泌的膠原纖維圍繞著心肌細(xì)胞形成的膠原網(wǎng)絡(luò)和散布其中的心肌間質(zhì)細(xì)胞組成，對(duì)心肌細(xì)胞起著支架保護(hù)、連接固定、力學(xué)傳導(dǎo)以及供給營(yíng)養(yǎng)的作用[13]。纖維化是多種心臟病的共同特征，心臟成纖維細(xì)胞已經(jīng)被證明對(duì)產(chǎn)生和調(diào)節(jié)纖維化有顯著貢獻(xiàn)[14]。心臟成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，將導(dǎo)致膠原蛋白過(guò)量積聚。生理狀態(tài)下心肌膠原纖維如Ⅰ型、Ⅲ型膠原能確保相鄰心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，保障心肌細(xì)胞收縮并完成整體左室泵功能。心肌纖維化時(shí)主要表現(xiàn)為各型膠原比例失衡，膠原蛋白含量增加及其結(jié)構(gòu)重排，進(jìn)而影響心臟功能，最終導(dǎo)致心力哀竭的發(fā)生[15]。因此，維持心臟成纖維細(xì)胞正常比例與功能對(duì)保證心臟功能的正常進(jìn)行具有重要作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，Zac可明顯降低膠原的含量，抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖，減輕纖維化。

血管緊張素Ⅱ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的主要作用因子之一，參與多種心臟疾病的病理發(fā)生過(guò)程，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和心肌間質(zhì)纖維化，是調(diào)節(jié)心肌纖維化和心室重構(gòu)的重要因素[16]。在各種心臟疾病過(guò)程中，Ang Ⅱ不僅刺激心肌細(xì)胞肥大、對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增生及間質(zhì)心肌纖維化也有作用，而后2種病理過(guò)程將增加非肌細(xì)胞間質(zhì)的成分，造成心室壁僵硬，順應(yīng)性降低，舒縮功能障礙，最終引發(fā)心力衰竭[17]。同時(shí)局部Ang Ⅱ產(chǎn)生增加與心肌細(xì)胞凋亡和反應(yīng)性間質(zhì)性纖維化有關(guān)[18]。本研究中采用Ang Ⅱ孵育CFb 24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ可以刺激CFb的細(xì)胞活力和膠原合成增加，促進(jìn)心肌纖維化，并降低心臟成纖維細(xì)胞凋亡；同時(shí)應(yīng)用Zac能夠降低Ang Ⅱ誘發(fā)的CFb增殖和膠原合成，誘導(dǎo)凋亡，提示具有抗心肌纖維化作用。心臟成纖維細(xì)胞的電生理特性將影響其激發(fā)分泌耦合，成纖維細(xì)胞—肌細(xì)胞偶聯(lián)以及成纖維細(xì)胞—成纖維細(xì)胞相互作用的能力。心肌細(xì)胞的靜息膜電位通常約為-80 mV，但成纖維細(xì)胞具有更多的陽(yáng)性靜息膜電位。據(jù)報(bào)道，使用常規(guī)細(xì)胞內(nèi)微電極記錄，心臟成纖維細(xì)胞原位靜息膜電位在-31～-16 mV之間[19]。然而對(duì)于哪些通道決定心臟成纖維細(xì)胞中的靜息膜電位并不是完全了解。由Kir2.1(IK1的亞單位之一)編碼的內(nèi)向整流鉀電流IK1可能有助于靜息膜電位[19]。研究表明，在成年大鼠心室肌成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞中，Kir電流是RMP的主要決定因素[19]。有研究表明，通過(guò)操縱大鼠心室成纖維細(xì)胞中IK1電流振幅的靜息膜電位的變化將影響肌成纖維細(xì)胞增殖；在狗快速起搏誘發(fā)的心力衰竭，心房成纖維細(xì)胞Kir2.1通道功能和表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了成纖維細(xì)胞增生，進(jìn)而形成心房重構(gòu)和房顫的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[20-21]。已知心衰時(shí)，心房肌細(xì)胞IK1上調(diào)是心房重構(gòu)和致房顫的電生理學(xué)基礎(chǔ)之一。這些結(jié)果說(shuō)明心衰時(shí)心房成纖維細(xì)胞IK1與心房肌細(xì)胞具有相似的電生理學(xué)改變，都參與心房的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)，具有協(xié)同效應(yīng)。與此相反，IK1下調(diào)是心衰時(shí)心室肌電重構(gòu)的重要特征[22]，激動(dòng)IK1理論上具有抗心肌重構(gòu)的作用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們分離并培養(yǎng)乳鼠心室成纖維細(xì)胞，給予AngⅡ后可以下調(diào)Kir2.1，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活力增加，經(jīng)Zac干預(yù)能夠上調(diào)Kir2.1，抑制其生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，本研究建立AngⅡ致心肌纖維化和心室重構(gòu)模型，利用IK1通道激動(dòng)劑Zac和相對(duì)特異性IK1通道阻斷劑氯喹與BaCl2，證明選擇性激動(dòng)IK1通道可能通過(guò)降低成纖維細(xì)胞的活力并誘導(dǎo)其凋亡而發(fā)揮抗心室重構(gòu)效應(yīng)，從而在細(xì)胞和分子水平為心室重構(gòu)病理過(guò)程中心肌纖維化提供新的理論依據(jù)，也為防治和逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)開(kāi)辟新的途徑。