白藜蘆醇對新生大鼠神經(jīng)元缺血缺氧時(shí)SDF-1/CXCR4通路抗凋亡作用的調(diào)控機(jī)制

閻 雯， 齊薛浩

(西安市兒童醫(yī)院 1新生兒一科， 2NICU科， 陜西 西安 710034)

新生兒缺血缺氧性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是指各種圍生期窒息導(dǎo)致的部分或完全缺氧、腦血流量減少或暫停所致的新生兒腦損傷，是造成新生兒永久性神經(jīng)功能障礙和死亡的一個(gè)重要原因。雖然近些年來新生兒重癥監(jiān)護(hù)有了很大的進(jìn)步，但是HIE的幸存者仍然面臨著終身的后遺癥，如發(fā)育遲緩、認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)障礙、腦麻痹、癲癇和自閉癥等[1]。HIE的發(fā)病機(jī)制目前尚未確定，但有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元凋亡在其發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[2]。白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是一種從葡萄和虎杖等多種水果和植物中提取出來的多酚類化合物。研究顯示，RSV具有包括抗癌、抗炎、抗心血管疾病、抗神經(jīng)退行性疾病和抗衰老等多種生物學(xué)作用[3-4]。最近有研究報(bào)道RSV能夠保護(hù)缺血缺氧誘導(dǎo)的新生兒腦損傷[5]，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

最近的研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)能夠改善腦損傷的新生大鼠的認(rèn)知功能，減少細(xì)胞凋亡和顱內(nèi)炎癥并誘導(dǎo)腦髓鞘再生，這可能是通過與其受體——CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)結(jié)合發(fā)揮作用的[6-7]。Hong等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，RSV通過上調(diào)心肌中SDF-1的表達(dá)和分泌，緩解小鼠急性心肌梗死癥狀，但是在新生兒HIE中RSV和SDF-1的關(guān)系還未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過對新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)行氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)處理模擬新生兒HIE模型，探究RSV是否是通過調(diào)控SDF-1/CXCR4通路抑制缺血缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。

材 料 和 方 法

1 材料

1.2主要試劑 胰酶和胎牛血清購自Gibco；DMEM/F12和DMEM培養(yǎng)基購自Thermo Fisher Scientific；RSV和CXCR4拮抗劑AMD3100購自Sigma；RNAiso Plus購自大連寶生物工程有限公司；cDNA合成試劑盒、Real-time PCR試劑盒、抗β-actin抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；抗SDF-1抗體購自Santa Cruz；抗微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein-2，MAP-2)、CXCR4、cleaved caspase-3、細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)、Bax和Bcl-2 抗體均購自Abcam；ECL發(fā)光液購自Millipore；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自BD。

2 方法

2.1新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的分離和鑒定 取出生24 h內(nèi)的新生SD大鼠，戊巴比妥鈉麻醉后，將其斷頭處死，用消毒過的眼科手術(shù)剪剪開頭皮和顱骨，將大腦兩側(cè)組織暴露出來。然后取出全腦，分離出皮層組織并剪成小組織塊，將組織塊使用0.25%胰酶于37 °C消化15 min，1 000 r/min離心5 min后棄胰酶，加入含有15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，并用一次性細(xì)口吸管輕輕反復(fù)吹打細(xì)胞，并經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，收集濾液，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，在細(xì)胞沉淀中加入含有15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，按照1×109/L的密度將細(xì)胞接種到多聚賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入37 °C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3天時(shí)，更換成含有5 μmol/L的阿糖胞苷(殺死非神經(jīng)元細(xì)胞)。培養(yǎng)至第6天時(shí)，采用MAP-2免疫熒光染色，鑒定神經(jīng)元純度大約為97%。

2.2MTT檢測不同濃度的RSV對神經(jīng)元活力的影響 將培養(yǎng)的原代神經(jīng)元過夜培養(yǎng)后，按照每孔1×103的密度接種到96孔板中，37 °C、5%CO2條件下過夜培養(yǎng)。參考文獻(xiàn)[9]，在過夜培養(yǎng)的細(xì)胞中加入含有不同濃度(0, 1, 10, 50,和100 μmol/L)的RSV的細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h，按照MTT試劑盒檢測各孔在570 nm處的吸光度(A)值。

2.3實(shí)驗(yàn)分組及HIE模型制備 首先將培養(yǎng)的神經(jīng)元隨機(jī)分成4組：對照(control)組、缺血缺氧模型(HIE)組、缺血缺氧+RSV低劑量(HIE+RSV-low)組和缺血缺氧+RSV高劑量(HIE+RSV-high)組。HIE模型制備：棄去神經(jīng)元的原培養(yǎng)液，換成無糖無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2、1% O2、94% N2的缺氧裝置中處理2 h，然后更換成含有糖和10% FBS的培養(yǎng)液，在常氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。對照組始終置于含有糖和10% 胎牛血清的培養(yǎng)液中并進(jìn)行常氧處理；HIE+RSV低劑量組在缺氧處理結(jié)束后立即加入10 μmol/L RSV，處理24 h；HIE+RSV高劑量組以同樣的方式加入50 μmol/L RSV。

為了驗(yàn)證RSV是否是通過SDF-1/CXCR4通路發(fā)揮作用的，將培養(yǎng)的原代神經(jīng)元隨機(jī)分成3組：缺血缺氧模型(HIE)組、缺血缺氧+RSV(HIE+RSV)組和缺血缺氧+RSV+AMD3100(HIE+RSV+AMD3100)組。這3組均按照上述方式給予缺血缺氧處理；RSV的使用劑量為50 μmol/L，按照上述方法加入；缺血缺氧結(jié)束后25 μmol/L AMD3100與50 μmol/L RSV同時(shí)加入，處理細(xì)胞24 h。

2.4Real-time PCR檢測mRNA表達(dá) 按照RNAiso Plus試劑盒說明書操作提取各組細(xì)胞的總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取RNA的完整性，核酸測定儀鑒定RNA的濃度及純度后，取2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后按照real-time PCR試劑盒說明書操作加入各組分進(jìn)行檢測。引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參照，按照2-ΔΔCt計(jì)算靶基因mRNA的相對表達(dá)量。

表1 Real-time PCR引物序列

2.5Western blot檢測蛋白水平 將細(xì)胞先用冰冷的PBS沖洗1遍，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞30 min，離心后收集上清液即為提取的蛋白質(zhì)。測定過濃度后，對蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE，每孔蛋白質(zhì)上樣量為30 μg。電泳完成后，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入提前準(zhǔn)備好的 I 抗稀釋液，4 °C過夜孵育。TBST緩沖液清洗后，加入 II 抗稀釋液室溫孵育1 h，再加入ECL發(fā)光液，拍照并分析蛋白質(zhì)的含量。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 使用Annexin V-FITC/PI雙染通過流式細(xì)胞術(shù)檢測RSV對缺血缺氧損傷的神經(jīng)元凋亡的影響。使用不含EDTA的胰酶消化RSV處理24 h的細(xì)胞，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的無菌PBS清洗2次后，按照凋亡試劑盒說明書操作檢測細(xì)胞凋亡早期和凋亡晚期的改變。

“北冥有魚，其名為鯤，鯤之大，不知其幾千里也?；鵀轼B，其名為鵬。鵬之背，不知其幾千里也。怒而飛，其翼若垂天之云。”這邊孫老神仙領(lǐng)眾人低誦《逍遙游》，已發(fā)動(dòng)了七絕陣法。北斗為帝車之象，是為轅軒，車，轉(zhuǎn)也，游也，變而為鯤鵬，天樞為首，天璇承之，天璣變換，天權(quán)取舍，玉衡猶疑，開陽振作，搖光波動(dòng)，一時(shí)五人掌力齊吐，顏真卿揮筆，蘇雨鸞奏琴陰陽變化，十二條內(nèi)力深淺方向各有不同，驚濤深流，形成漩渦，將三個(gè)少年席卷而入。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)最少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異的比較使用單因素方差分析并進(jìn)行Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 白藜蘆醇能夠抑制缺血缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡

首先檢測不同濃度的RSV對細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，1、10和50 μmol/L RSV對正常培養(yǎng)的神經(jīng)元的活力影響不大，但是100 μmol/L RSV能夠抑制神經(jīng)元的活力(P<0.01)，見圖1A。

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，與對照組相比，HIE組中細(xì)胞的凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與HIE組相比，HIE+RSV組中細(xì)胞的凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且高劑量的RSV組中凋亡率更低，見圖1B。

Figure 1. Resveratrol (RSV) inhibited the apoptosis of neurons induced by hypoxic-ischemic injury. A: the effects of different concentrations (0, 1, 10, 50 and 100 μmol/L) of RSV on the viability of neurons were determined by MTT assay; B: flow cytometry analysis for the apoptosis of neurons with different treatments. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHIE group.

圖1白藜蘆醇能夠抑制缺血缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡

2 白藜蘆醇對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測各組中凋亡相關(guān)蛋白水平，結(jié)果示,與對照組相比，HIE組中活化的caspase-3和Cyt C的蛋白水平增加，Bcl-2/Bax值降低(P<0.05)；與HIE組相比，HIE+RSV組中活化的caspase-3和Cyt C的蛋白水平降低，Bcl-2/Bax值升高(P<0.05)，且高劑量的RSV組中變化更加明顯,見圖2。

3 白藜蘆醇能夠上調(diào)SDF-1和CXCR4的表達(dá)

用real-time PCR檢測SDF-1和CXCR4的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，HIE組中SDF-1和CXCR4的mRNA表達(dá)增加(P<0.05)；與HIE組相比，HIE+RSV組中SDF-1和CXCR4的mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，且高劑量的RSV組中表達(dá)更高，見圖3A、B。

用Western blot檢測了SDF-1和CXCR4蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，HIE組中SDF-1和CXCR4的蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；與HIE組相比，HIE+RSV組中SDF-1和CXCR4的蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，且高劑量的RSV組中表達(dá)更高，見圖3C。

Figure 2. The effects of resveratrol (RSV) on the levels of apoptosis-related proteins. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHIE group.

圖2白藜蘆醇對凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

Figure 3. The effects of resveratrol (RSV) on the expression of SDF-1 and CXCR4 at mRNA and protein levels determined by real-time PCR (A and B) and Western blot (C). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHIE group.

圖3白藜蘆醇對SDF-1和CXCR4mRNA和蛋白表達(dá)的影響

4 CXCR4拮抗劑能夠減弱白藜蘆醇對神經(jīng)元凋亡的影響

使用CXCR4的拮抗劑AMD3100與RSV共同處理缺血缺氧的細(xì)胞，結(jié)果如圖4所示。與HIE+RSV組相比，HIE+RSV+AMD3100組中細(xì)胞的凋亡率增加，活化的caspase-3和Cyt C的表達(dá)增加，Bcl-2/Bax值降低(P<0.01)，見圖4。

Figure 4. CXCR4 antagonist AMD3100 attenuated the effect of resveratrol (RSV) on the apoptosis of neurons. A: flow cytometry for analyzing the apoptosis of neurons; B: Western blot for determining the protein levels of cleaved caspase-3, Bax, Bcl-2 and Cyt C in the primary neurons treated with RSV combined with or without AMD3100 after HIE injury. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsHIE group;△△P<0.01vsHIE+RSV group.

圖4CXCR4拮抗劑AMD3100能夠減弱白藜蘆醇對神經(jīng)元凋亡的影響

討 論

新生兒HIE是一種與神經(jīng)元凋亡相關(guān)的神經(jīng)功能障礙性疾病。其發(fā)病機(jī)制包括凋亡、興奮性神經(jīng)毒性、炎癥和氧化應(yīng)激等[10]。最新的研究顯示RSV處理可以減少缺血缺氧誘導(dǎo)的新生大鼠腦損傷[5]，但其詳細(xì)的作用機(jī)制尚不清楚。目前在體外用OGD處理神經(jīng)元模擬體內(nèi)神經(jīng)元的缺血缺氧損傷，已被廣泛應(yīng)用于HIE的研究[11-12]。因此，本研究通過OGD處理模擬神經(jīng)元缺血缺氧損傷探究RSV對新生兒HIE的作用機(jī)制。

Bcl-2蛋白家族包含促凋亡蛋白(如Bax)和抗凋亡蛋白(如Bcl-2)，該家族蛋白在調(diào)控線粒體凋亡通路中發(fā)揮著重要作用。促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白的比例是凋亡的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，研究顯示Bcl-2與Bax的比例能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡[12]。Bcl-2家族蛋白的平衡能夠調(diào)節(jié)Cyt C的釋放，而Cyt C參與凋亡復(fù)合體的形成并調(diào)節(jié)胱天蛋白酶如caspase-3的活化，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，OGD處理后神經(jīng)元的凋亡明顯增加；同時(shí)，活化的caspase-3和Cyt C的釋放增加，Bcl-2/Bax值降低。這表明本研究中OGD處理成功模擬了缺血缺氧損傷，造成了神經(jīng)元凋亡。

本研究首先使用不同濃度的RSV處理正常培養(yǎng)的神經(jīng)元，檢測其對細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)1、 10和50 μmol/L的RSV對細(xì)胞活力無影響，但是濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)能夠抑制細(xì)胞活力。先前的文獻(xiàn)顯示，RSV對損傷神經(jīng)元的作用具有劑量依賴性[9]，因此我們選擇10和50 μmol/L的RSV進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究中OGD損傷后使用10和50 μmol/L的RSV處理發(fā)現(xiàn)，RSV能夠減弱OGD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，降低活化的caspase-3和Cyt C的釋放，上調(diào)Bcl-2/Bax值，高濃度的RSV對這些變化的影響更加明顯。這些結(jié)果表明RSV能夠緩解缺血缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。

SDF-1在內(nèi)皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞中組成型表達(dá)，通過與其受體CXCR4結(jié)合，在調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性方面發(fā)揮重要作用[6,13]。缺氧能夠上調(diào)SDF-1和CXCR4的表達(dá)[14]，本研究也發(fā)現(xiàn)OGD處理能夠上調(diào)SDF-1和CXCR4 mRNA和蛋白表達(dá)。有研究表明SDF-1/CXCR4信號通路能夠介導(dǎo)祖細(xì)胞向缺血性心肌組織的歸巢現(xiàn)象[14]。SDF-1表達(dá)增加也參與干細(xì)胞向腎臟損傷部位的募集進(jìn)而減弱腎臟缺血再灌注損傷過程[15]。Mori等[6]的研究表明SDF-1在新生兒大腦損傷的神經(jīng)保護(hù)方面具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，與HIE組相比，RSV處理后能夠上調(diào)SDF-1和CXCR4 mRNA和蛋白水平的表達(dá)，且高劑量RSV對兩者表達(dá)的上調(diào)作用更加明顯。這表明RSV減弱缺血缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡可能與SDF-1和CXCR4表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

先前的研究顯示，AMD3100是CXCR4的拮抗劑，可以阻斷SDF-1/CXCR4通路[16]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證RSV是否是通過SDF-1/CXCR4通路發(fā)揮作用，我們使用了AMD3100，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與RSV單獨(dú)處理相比，AMD3100和RSV共同處理的細(xì)胞凋亡率增加，活化的caspase-3和Cyt C的釋放增加，Bcl-2/Bax值降低，這進(jìn)一步確證了RSV是通過SDF-1/CXCR4通路發(fā)揮作用的?？傊?，本研究結(jié)果表明RSV通過上調(diào)SDF-1/CXCR4通路抑制缺血缺氧誘導(dǎo)的新生大鼠神經(jīng)元的凋亡。