羥基磷灰石誘導脂肪間充質(zhì)干細胞成骨分化的實驗研究

程勝承，劉義，景亞青，鞠明艷，李光

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的單克隆成體干細胞，可以在一定誘導條件下向成肌、成脂、成骨、成軟骨等多個方向分化［1］。MSCs具有支持造血、低免疫原性等優(yōu)勢［2］，可用于自體或同種異體治療［3］。MSCs分布廣泛，骨髓、脂肪、骨片、牙髓、胎盤、臍帶等多種組織中均可分離培養(yǎng)出MSCs［4］。其中，骨髓來源的MSCs——骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是目前研究最為清楚的MSCs之一，但是可提取的細胞數(shù)量相對較少，傳代能力較弱，通常傳代次數(shù)不超過6～10代［5］。脂肪來源的MSCs——脂肪間充質(zhì)干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）因來源較容易、細胞數(shù)量較多、增殖能力較BMSCs更強，且對生物體的損傷也更小，近年來被廣泛應用［6］。然而，相對于BMSCs，較弱的成骨能力限制了ADSCs在骨相關疾病中的治療作用。羥基磷灰石［Ca10（PO4）6（OH）2］（hydroxyapatite，HA）是人或動物骨骼和牙齒無機質(zhì)的主要成分，在人體的骨骼中質(zhì)量分數(shù)約為60%，而在牙齒中可高達95%以上［7］。人工合成的HA的組成和結晶結構均類似于人體自然骨骼，并且相態(tài)比較穩(wěn)定、無毒性，不會引起炎癥反應，具有良好的生物活性和生物相容性，適用于引導骨骼的生長［8］，因此近年來成為了骨修復的良好材料之一［9］。本文通過研究HA對ADSCs成骨能力的影響，以拓展ADSCs在骨組織工程中的應用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 6周齡C57BL/6雄鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司），0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（含酚紅）、Ⅰ型膠原蛋白酶、胎牛血清［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］，離心機（艾本德中國有限公司），水浴鍋（天津歐諾儀器股份有限公司），40μm細胞篩（美國康寧公司），鼠源抗體（北京安必奇生物科技有限公司），光學倒置顯微鏡［尼康儀器（上海）有限公司］，Nanodrop 2000、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］，恒溫細胞培養(yǎng)箱［雅馬拓科技貿(mào)易（上海）有限公司］，酶標儀（上海Bio-Rad Laboratories有限公司），堿性磷酸酶檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR儀（上海睿鉑賽生物科技有限公司），CCK-8試劑盒（北京智杰方遠科技有限公司），羥基磷灰石粉末（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 ADSCs原代分離培養(yǎng) 選取6周齡無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級的野生型C57BL/6雄鼠，麻醉后頸椎脫臼法處死，用體積分數(shù)75%的乙醇浸泡5 min。在無菌操作臺中，使用剪刀和鑷子剝離小鼠腋下、腹股溝皮下和附睪周圍脂肪組織。將分離的脂肪組織放置在培養(yǎng)皿中，用含有青鏈霉素的PBS沖洗2～3次，洗去雜質(zhì)，并快速剪碎脂肪團塊。用0.2%的Ⅰ型膠原酶溶液于37℃恒溫搖床200 r/min消化0.8～1 h，加入含0.2%胎牛血清的α-MEM細胞培養(yǎng)基終止消化反應。用孔徑為40μm篩網(wǎng)濾去脂肪殘塊，細胞懸液收集至50 mL離心管中。1 500 r/min離心5 min，棄上清，用含15%胎牛血清的α-MEM細胞培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，并將懸液移至10 cm培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 ADSCs的純化及傳代培養(yǎng) 脂肪細胞培養(yǎng)72 h后，吸去3 mL培養(yǎng)液，并加入3 mL新的培養(yǎng)液。培養(yǎng)96 h后吸去培養(yǎng)液，并用PBS洗2遍，再加入6 mL含有1%青鏈霉素混合液、15%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，以后每隔48 h更換1次培養(yǎng)液。待原代細胞密度長至90%左右，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細胞，按照1∶2的比例進行傳代。

1.2.3 ADSCs的鑒定 （1）取培養(yǎng)至第二代的ADSCs，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液37℃處理4 min，加入含0.2%胎牛血清的α-MEM細胞培養(yǎng)基終止消化，1 500 r/min離心5 min收集細胞。棄上清，將收集到的細胞用PBS重懸，再次1 500 r/min離心5 min收集細胞。重復以上操作1次。（2）再次將收集到的細胞沉淀用1 mL的PBS重懸，平均分配到5個1.5 mL無菌無酶的EP管中（200μL/管），1 500 r/min離心5 min，棄掉上清液，使用剩下的50μL PBS繼續(xù)重懸細胞，分別將 5個 EP 管標記為：Blank、FITC-CD45、PE-CD44、PECD29、PE-Sca1，分別加入相應鼠源抗體1μL（抗體放置于冰箱內(nèi)4℃保存）。（3）4℃避光孵育30 min，加入200μL PBS后，1 500 r/min離心5 min，棄掉上清，加入200μL 4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）重懸細胞并固定1 h，，固定完成后，1 500 r/min離心5 min，棄掉PFA，用PBS重新懸浮細胞，4℃冰箱保存，以待流式細胞儀測試。

1.2.4 HA細胞毒性檢測 將ADSCs提前接種至96孔細胞培養(yǎng)板中（1×104個/孔），24 h后細胞完全貼壁，按濃度梯度（0、5、10、20、50、100、500 mg/L）加入配制好的HA懸浮液，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，每孔加入10μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用酶標儀測定450 nm處的吸光度（A）值。

1.2.5 HA對ADSCs的成骨誘導作用 將分別含有0、5、10、20、50、100、500 mg/L的HA混合液以每孔500μL接種到24孔細胞培養(yǎng)板中，靜置4 h后每孔接種6×104個ADSCs。置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，觀察細胞的貼壁情況。之后每48 h更換含5%胎牛血清的α-MEM細胞培養(yǎng)基，15 d后完成誘導過程，使用4%PFA固定30 min后，對細胞進行堿性磷酸酶染色，并觀察染色結果。

1.2.6 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測HA對ADSCs成骨能力的影響 Trizol法提取HA成骨誘導15 d后ADSCs的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR測定經(jīng)HA誘導的ADSCs成骨相關基因骨鈣素（BGLAP）、堿性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型膠原（COL1A1）、骨橋蛋白（OPN）、Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）mRNA表達量，引物序列見表1。反應條件：95℃5 min；95 ℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。通過熔解曲線分析初步鑒定PCR反應的特異性。數(shù)據(jù)的收集由實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR儀自帶軟件完成，采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析，以0 mg/L的HA誘導組數(shù)據(jù)作為參照。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗法。P＜0.05時為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ADSCs的生長情況 原代細胞培養(yǎng)至72 h，顯微鏡下觀察到較多的脂肪滴及過濾沉淀雜質(zhì)，見圖1A。72 h后，細胞的數(shù)量開始增多，96 h時可見大部分細胞呈梭形或多邊形，不規(guī)則貼壁生長，并有較多圓形細胞懸浮，見圖1B。傳代后細胞增殖的速度加快，細胞呈長梭形，細胞質(zhì)有突起且豐富，細胞輪廓清晰，整體呈旋渦狀排列，具有典型的ADSCs形態(tài)特點，見圖1C、D。

Tab.1 Primer for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物列表

Fig.1 Isolation and culture of primary ADSCs(×100)圖1 原代ADSCs的分離培養(yǎng)（×100）

2.2 ADSCs的鑒定 結果顯示，造血干細胞表面標志物FITC-CD45（1.23%）陰性表達，間充質(zhì)干細胞表面標志物PE-CD29（98.8%）、PE-CD44（81.4%）、PESca1（81.3%）陽性表達，見圖2。

2.3 HA對ADSCs增殖的影響 加入CCK-8檢測試劑4 h后，加入HA的培養(yǎng)基顏色變化如圖3A～G，0、5、10、20 mg/L這4個梯度培養(yǎng)基的顏色變化差異較小，從50 mg/L開始顏色變淡，說明較高濃度的HA會抑制ADSCs的增殖。HA≤20 mg/L時，對細胞的生長無明顯影響，見圖3H。

2.4 HA誘導ADSCs成骨分化 經(jīng)HA誘導15 d的ADSCs進行ALP染色，結果顯示0 mg/L HA誘導組未出現(xiàn)藍色，20 mg/L HA誘導組染色面積最大，證明有較好的誘導成骨分化作用，見圖4。

Fig.2 Flow cytometry detection of ADSCs圖2 流式細胞儀檢測ADSCs

Fig.3 The effect of HA on the proliferation of ADSCs圖3 HA對ADSCs增殖的影響

Fig.4 ALPsecretionofADSCsinducedbydifferentconcentrationsofHA圖4 不同濃度HA誘導ADSCs后ALP的分泌量變化

2.5 qRT-PCR結果分析 通過對誘導ADSCs基因表達量檢測，分析了不同濃度HA對ADSCs成骨相關基因表達的影響，見圖5。與0 mg/L組相比，其余各組 ALP、COL1A1、OPN、Runx2表達均升高，在BGLAP中，與0 mg/L組相比，20 mg/L表達升高，100 mg/L表達降低，其余各組無差別。與20 mg/L組相比，5 mg/L、50 mg/L、100 mg/L組中BGLAP的表達量降低，COL1A1的表達量無差別。

3 討論

目前，MSCs是臨床應用范圍最廣、安全性最高的干細胞之一，其來源十分廣泛，從骨髓、脂肪、牙髓、真皮、軟骨膜、關節(jié)軟骨、臍帶、胎盤等眾多組織中均可分離提取。ADSCs主要來源于脂肪組織，容易大量獲取細胞，在近年來的研究中越來越受關注［10］。

3.1 ADSCs具有成骨分化的能力 ADSCs具有來源充足、免疫原性低［11］、體外容易培養(yǎng)、增殖能力較強的特點。有研究顯示，經(jīng)過多種誘導因子的加入，可以使ADSCs向成骨細胞誘導分化，以此來治療骨損傷［12］。原代ADSCs多呈集落樣貼壁生長，細胞形態(tài)呈長梭形或多邊形［13］。ADSCs完成原代集落形成后即可穩(wěn)定擴增。經(jīng)過成骨誘導的ADSCs通常會表達ALP和COL1A1，隨后在基質(zhì)中出現(xiàn)鈣沉積，進而形成鈣結節(jié)。COL1A1的分泌是增殖期開始的標志，成骨細胞分化早期的標志是ALP的分泌，分泌量越高，說明其活性越高，向成骨細胞分化的能力越強［14］。

3.2 HA具有成骨誘導能力 目前，HA作為骨組織工程中的常用支架材料，可與多種MSCs和生物因子混合制作成種類繁多的骨修復材料［15-16］，并且HA對成骨細胞有較強的黏附性，可以促進成骨細胞的增殖［17］，以及細胞外基質(zhì)的分泌，調(diào)節(jié)修復部位的微環(huán)境，促進膠原形成，進而促進骨折損傷后修復［18-19］。有研究表明，利用HA與COL1A1支架與BMSCs共培養(yǎng)21 d后，通過電鏡掃描分析，發(fā)現(xiàn)支架上形成了大量的礦物沉積，部分細胞發(fā)生鈣化，說明HA對BMSCs具有良好的成骨誘導能力［19］。

Fig.5 Osteogenic gene expression of ADSCs induced by hydroxyapatite圖5 經(jīng)HA誘導后的ADSCs成骨基因表達

3.3 HA對ADSCs具有成骨誘導作用 本文針對HA對ADSCs的成骨分化能力進行探究，選用了7個濃度梯度來觀察不同量的HA對ADSCs的影響，結果表明，在≤20 mg/L時，HA對ADSCs的增殖影響較小。隨后通過ALP染色，觀察HA對ADSCs的誘導成骨分化作用，結果顯示，經(jīng)HA誘導的細胞均被染上藍色，說明HA具有誘導ADSCs成骨分化的能力［20-21］。為了進一步驗證成骨分化能力，qRT-PCR檢測了成骨相關基因的表達情況，結果顯示，20 mg/L的HA誘導ADSCs向成骨細胞分化的作用最明顯，成骨相關基因的表達明顯升高。BGLAP是骨組織的特異性蛋白，也是骨細胞分化成熟的標志。HA為20 mg/L時，BGLAP表達較高，結合所有基因的表達情況，證明HA可以誘導ADSCs向成骨細胞分化。

綜上所述，HA具有誘導ADSCs向成骨細胞分化的能力，為兩者混合制作成新的骨支架修復材料提供了理論基礎。