亞低溫促進(jìn)大鼠顱腦創(chuàng)傷后海馬新生神經(jīng)元長期存活及成熟

王晶，徐超，李曉紅，涂悅，陳翀，馬鐵柱，王麗娜，朱旭，任吉濱，許子寧，楊慧云，張賽△

顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，是導(dǎo)致我國青壯年死亡及致殘的主要原因之一，給社會和家庭帶來了沉重負(fù)擔(dān)［1］。神經(jīng)發(fā)生主要包括神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）增殖、遷移、分化及存活等多個過程，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化使新生神經(jīng)元（newborn neurons）在哺乳動物大腦中持續(xù)存在［2］。研究證實TBI后海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）區(qū)神經(jīng)發(fā)生增加，神經(jīng)元前體細(xì)胞在損傷側(cè)DG區(qū)聚集并整合入現(xiàn)有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，海馬區(qū)新生神經(jīng)元長期存活及成熟可能有助于TBI后神經(jīng)功能恢復(fù)［3-4］。亞低溫（mild hypothermia，MHT）具有抑制TBI后繼發(fā)性損傷過程中某些破壞性代謝途徑的潛力，進(jìn)而影響神經(jīng)發(fā)生過程，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［5］。本研究旨在探討MHT是否可促進(jìn)TBI后海馬DG區(qū)新生神經(jīng)元細(xì)胞長期存活及成熟，進(jìn)而促進(jìn)TBI后神經(jīng)功能恢復(fù)，以期探討MHT療法減緩TBI的有效性及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 59只SPF級成年雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量240～280 g，均購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)（sham）組（n=15）、TBI組（n=22）及TBI+MHT組（n=22）。MODEL01-B液壓顱腦損傷儀由美國弗吉利亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院研制，T1型亞低溫治療儀購于中國珠海黑馬（Hema）公司。大鼠抗5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）抗體、兔抗NeuN抗體（Abcam，英國）；FITC標(biāo)記山羊抗大鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗、核熒光染料4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI；Invitrogen，美國）。

1.2 動物模型的建立 TBI組及TBI+MHT組動物稱體質(zhì)量，5%水合氯醛（7 mL/kg）經(jīng)腹腔注射麻醉，固定頭部。備皮消毒，頭皮正中切口3 cm，剝離骨膜，以前囟后3.8 mm、中線右側(cè)2.5 mm為中心，開直徑4.0 mm圓形骨窗，暴露完整硬腦膜。置內(nèi)徑2.6 mm打擊管，增強(qiáng)型牙科磷酸鋅水門汀將打擊管固定于顱骨上，管內(nèi)充滿生理鹽水，連接液壓沖擊腦損傷儀（2.0 atm，1 atm=101.325 kPa）打擊骨窗建立重型TBI模型，TBI后骨蠟止血，逐層縫合手術(shù)切口并消毒。sham組動物暴露完整硬腦膜后直接逐層縫合手術(shù)切口并消毒，不進(jìn)行液壓打擊，暴露硬腦膜過程同前。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 MHT的實施 重型TBI模型建立后，立即將動物置于降溫冰毯上接受MHT治療，降溫后直腸目標(biāo)溫度33.5℃，維持4 h，1.5 h內(nèi)緩慢復(fù)溫至37℃。MHT治療過程中若出現(xiàn)呼吸抑制，立即給予經(jīng)口氣管插管，采用小動物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣直至產(chǎn)生自主呼吸。所有操作完成后常規(guī)喂養(yǎng)動物，自由飲水，白晝與夜晚各12 h，環(huán)境溫度（37±1）℃。

1.4 Morris水迷宮試驗 于造模后21～26 d連續(xù)每天訓(xùn)練大鼠記憶水迷宮中隱藏平臺的能力，記錄從大鼠入水到找到平臺所需的時間，即逃避潛伏期。在造模后第28天撤去平臺，測量大鼠穿越平臺的次數(shù)及停留在目標(biāo)象限中的時間。

1.5 BrdU腹腔注射 標(biāo)記新生有絲分裂細(xì)胞于大鼠造模后連續(xù)5 d腹腔注射BrdU，每隔12 h注射1次，每日2次，共10次，劑量150 mg/kg，各組大鼠于造模后1、4、8周分別隨機(jī)挑選5只，進(jìn)行大鼠的灌流固定及取材。

1.6 改良神經(jīng)功能缺損評分評估神經(jīng)功能恢復(fù)情況 TBI組及TBI+MHT組各隨機(jī)選取12只大鼠，分別于造模后1、2、4周對兩組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分（Modified neurological severity scores，mNSS），評分由運動試驗（提尾試驗、異?；顒樱⒏杏X試驗（視覺、觸覺及本體感覺）、平衡木試驗、反射活動及異常運動組成，得分在0～18分，分值越低表示神經(jīng)功能越好。

1.7 免疫熒光染色檢測大鼠海馬BrdU、NeuN表達(dá) 選取腦組織切片置于1 mol/L HCl中4℃處理10 min，2 mol/L HCl常溫處理10 min，37℃處理20 min，0.01 mol/L硼酸溶液中和10 min，PBS洗5 min× 3次；0.5%TritonX-100浸泡20 min，PBS洗5 min×3次；滴加5%BSA 100μL/片封閉，37℃孵育15 min，用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加一抗BrdU（1∶100）、NeuN（1∶200），放入濕盒后置于4℃冰箱過夜；隔日切片室溫復(fù)蘇1 h，PBS洗5 min×3次；滴加二抗，37℃溫箱避光50 min，PBS洗5 min× 3次；滴加DAPI，PBS洗5 min× 3次，50%甘油封片。在100倍熒光顯微鏡下以損傷側(cè)海馬作為觀察區(qū)域，選取連續(xù)5張腦組織切片分別計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，最后算出5張切片的平均陽性細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮試驗結(jié)果 與sham組相比，TBI組大鼠的逃避潛伏期顯著延長，平臺穿越次數(shù)及目標(biāo)象限停留時間均明顯減少（P＜0.01）。與TBI組相比，TBI+MHT組大鼠的逃避潛伏期縮短（P＜0.05），平臺穿越次數(shù)及目標(biāo)象限停留時間均增加（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of the results of Morris water maze test between three groups表1 各組Morris水迷宮試驗結(jié)果比較 （n=12,±s）

Tab.1 Comparison of the results of Morris water maze test between three groups表1 各組Morris水迷宮試驗結(jié)果比較 （n=12,±s）

＊＊P＜0.01；a與sham組比較，b與TBI組比較，P＜0.05

組別sham組TBI組TBI+MHT組F逃避潛伏期（s）8.243±2.663 19.384±4.730a 14.640±3.036ab 26.670＊＊平臺穿越次數(shù)（次）4.667±1.179 1.833±0.687a 3.333±0.850ab 25.670＊＊目標(biāo)象限停留時間（s）33.066±5.558 19.882±5.170a 25.538±3.896ab 19.830＊＊

2.2 TBI組及TBI+MHT組mNSS評分比較 因sham組大鼠神經(jīng)功能無缺損過程，實驗進(jìn)行mNSS評分的目的在于比較大鼠神經(jīng)功能缺損后的恢復(fù)情況，因此未將sham組納入比較。與TBI組比較，TBI+MHT組大鼠的mNSS評分在損傷后1、2及4周均降低（P＜0.01），見表2。

Tab.2 Comparison of modified neurological severity scores between TBI group and TBI+MHT group表2 TBI組及TBI+MHT組mNSS評分比較（n=12，分，±s）

Tab.2 Comparison of modified neurological severity scores between TBI group and TBI+MHT group表2 TBI組及TBI+MHT組mNSS評分比較（n=12，分，±s）

＊＊P＜0.01

組別TBI組TBI+MHT組t傷后1周7.083±0.954 5.250±1.010 4.376＊＊傷后2周5.250±0.829 3.250±0.722 6.034＊＊傷后4周3.833±0.553 2.500±1.190 3.588＊＊

2.3 損傷后各組BrdU免疫熒光染色結(jié)果 與sham組相比，損傷后1、4、8周TBI組和TBI+MHT組大鼠損傷側(cè)海馬齒狀回區(qū)BrdU陽性細(xì)胞均增加，且TBI+MHT組較TBI組顯著增加（P＜0.05）。此外，TBI組BrdU陽性細(xì)胞在損傷后4周及8周較損傷后1周均減少，損傷后8周較損傷后4周減少（P＜0.05），而TBI+MHT組在損傷后4周較損傷后1周進(jìn)一步增加（P＜0.05），損傷后8周較損傷后1周及4周無差異，見表3。

2.4 損傷后各組BrdU/NeuN雙標(biāo)記免疫熒光染色結(jié)果 損傷后1、4、8周，TBI組及TBI+MHT組大鼠損傷側(cè)海馬DG區(qū)BrdU/NeuN雙標(biāo)記陽性細(xì)胞從顆粒下層（SGZ）逐漸向顆粒細(xì)胞層（GCL）移位，見圖1。傷后各時間點TBI組及TBI+MHT組BrdU/NeuN雙陽性細(xì)胞數(shù)均較sham組增加，且與TBI組比較，TBI+MHT組雙陽性細(xì)胞數(shù)在各時間點均顯著增加（P＜0.05）。此外，與損傷后1周相比，TBI組損傷后4周及8周BrdU/NeuN雙陽性細(xì)胞數(shù)減少，而TBI+MHT組雙陽性細(xì)胞數(shù)增加，該兩組損傷后8周與損傷后4周比較均無差異，見表4。

Fig.1 Double immunostaining of BrdU/NeuN in injured hippocampus of three groups at each time point after injury(×100)圖1 傷后各時間點各組損傷側(cè)海馬Brdu/NeuN雙標(biāo)記免疫熒光染色結(jié)果（×100）

Tab.3 Comparison of BrdU-labeled cells in injured hippocampus at 1,4 and 8 weeks after injury between three groups表3 傷后1周、4周及8周各組損傷側(cè)海馬BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)比較 （n=5，個，±s）

Tab.3 Comparison of BrdU-labeled cells in injured hippocampus at 1,4 and 8 weeks after injury between three groups表3 傷后1周、4周及8周各組損傷側(cè)海馬BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)比較 （n=5，個，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與sham組比較，b與TBI組比較，A與傷后1周比較，B與傷后4周比較，P＜0.05

組別sham組TBI組TBI+MHT組F傷后1周9.20±1.17 32.80±4.75a 44.40±5.54ab 70.770＊＊傷后4周8.80±3.25 22.80±6.11aA 54.20±10.38abA 41.660＊＊傷后8周5.20±3.54 16.40±3.14aAB 42.20±10.76ab 35.720＊＊F 2.379 11.750＊＊5.976＊

Tab.4 Comparison of Brdu/NeuN double-labeled cells in injured hippocampus at 1,4 and 8 weeks after injury between three groups表4 傷后1周、4周及8周各組損傷側(cè)海馬Brdu/NeuN雙標(biāo)記細(xì)胞表達(dá)數(shù)比較 （n=5，個，±s）

Tab.4 Comparison of Brdu/NeuN double-labeled cells in injured hippocampus at 1,4 and 8 weeks after injury between three groups表4 傷后1周、4周及8周各組損傷側(cè)海馬Brdu/NeuN雙標(biāo)記細(xì)胞表達(dá)數(shù)比較 （n=5，個，±s）

＊＊P＜0.01；a與sham組比較，b與TBI組比較，A與傷后1周比較，P＜0.05

組別sham組TBI組TBI+MHT組F傷后1周1.088±0.413 8.800±2.638a 13.200±1.166ab 53.341＊＊傷后4周0.622±0.457 4.800±1.600aA 17.200±2.135abA 122.417＊＊傷后8周0.478±0.391 2.800±0.748aA 17.200±1.720abA 270.351＊＊F 2.862 11.110＊＊7.207＊＊

3 討論

3.1 MHT可促進(jìn)TBI后神經(jīng)功能缺損的修復(fù) TBI是耗費社會成本的重大健康問題，TBI后很多患者出現(xiàn)偏癱、失語及記憶力減退等神經(jīng)功能缺損及預(yù)后不良表現(xiàn)，目前尚無十分有效的治療方法［6］。海馬區(qū)是神經(jīng)發(fā)生的重要部位，與大腦學(xué)習(xí)記憶等功能密切相關(guān)，而DG區(qū)是海馬的關(guān)鍵性組成部分，因此研究TBI誘導(dǎo)的海馬DG區(qū)神經(jīng)發(fā)生對海馬功能及神經(jīng)功能缺損修復(fù)的潛在影響十分必要。TBI后神經(jīng)功能缺損涉及多種病理機(jī)制，有效的治療應(yīng)是指能夠抑制繼發(fā)性損傷并擴(kuò)大內(nèi)源性神經(jīng)可塑性的治療［7-8］。MHT是一種應(yīng)用藥物或物理方法使患者體溫下降至目標(biāo)溫度，以達(dá)到治療目的的治療方法。20世紀(jì)90年代至今，MHT治療TBI逐漸被研究者及臨床工作者所關(guān)注，但療效仍存在爭議。研究已證實，MHT可通過多種神經(jīng)保護(hù)機(jī)制抑制TBI后繼發(fā)性腦損傷過程，如降低腦耗氧量、抑制乳酸堆積、降低顱內(nèi)壓、維持正常腦代謝等從而降低TBI患者的病死率，改善神經(jīng)功能預(yù)后［9］。但也有研究報道MHT對TBI患者神經(jīng)功能預(yù)后可能無影響甚至可導(dǎo)致預(yù)后不良［10］。本研究顯示MHT可引起大鼠逃避潛伏期縮短、穿越平臺次數(shù)及目標(biāo)象限停留時間增加、mNSS評分降低，表明MHT可促進(jìn)TBI大鼠的學(xué)習(xí)及記憶功能恢復(fù)，減輕TBI后神經(jīng)功能缺損，并促進(jìn)TBI后神經(jīng)功能缺損恢復(fù)。

3.2 TBI后海馬DG區(qū)神經(jīng)發(fā)生增加但并不持久 神經(jīng)發(fā)生主要存在于成年哺乳動物大腦的兩個區(qū)域：腦室下區(qū)（SVZ）及海馬DG區(qū)［3］，研究TBI后海馬神經(jīng)發(fā)生過程對進(jìn)一步認(rèn)識TBI后腦及神經(jīng)功能變化十分必要。成體海馬神經(jīng)發(fā)生是新生功能性神經(jīng)元整合入海馬DG區(qū)現(xiàn)有回路的過程，由多個層次的病理生理活動共同調(diào)控，包括成體NSCs或前體神經(jīng)細(xì)胞增殖、祖細(xì)胞分化及新生神經(jīng)元存活和成熟等［3，11］。成體NSCs是神經(jīng)系統(tǒng)中一類可以自我更新并向各個類型神經(jīng)細(xì)胞分化的細(xì)胞。盡管研究已證實TBI后新生神經(jīng)元細(xì)胞及成體NSCs會大量增殖［12］，但TBI對神經(jīng)發(fā)生的影響仍存在爭議。有研究表明，TBI后神經(jīng)發(fā)生增加［13-14］；有研究則表明TBI后神經(jīng)發(fā)生并未發(fā)生變化［15］；還有研究報道TBI后神經(jīng)發(fā)生減少［16］。為了明確TBI后神經(jīng)發(fā)生的變化，本研究將核苷酸類似物BrdU作為細(xì)胞示蹤劑引入有絲分裂細(xì)胞，結(jié)果顯示TBI在損傷后1周促進(jìn)海馬DG區(qū)NSCs的“爆發(fā)性”增殖，但并不持久（未持續(xù)至損傷后4周及8周）。

3.3 MHT可促進(jìn)TBI后海馬DG區(qū)長期持續(xù)性神經(jīng)發(fā)生 神經(jīng)細(xì)胞生成階段及新生神經(jīng)元整合階段是海馬DG區(qū)神經(jīng)發(fā)生的兩個關(guān)鍵性時期。有研究表明，神經(jīng)發(fā)生作用對海馬功能可塑性具有重要意義［17］，不能進(jìn)一步發(fā)育為成熟神經(jīng)元的新生神經(jīng)元細(xì)胞將會在新生后1周內(nèi)死亡［18-19］。因此，在出現(xiàn)后進(jìn)一步發(fā)育為成神經(jīng)細(xì)胞或成熟神經(jīng)元對TBT后海馬DG區(qū)新生細(xì)胞存活至關(guān)重要。已有研究證實，成年大鼠海馬DG區(qū)SGZ層增殖的前體細(xì)胞可形成中間祖細(xì)胞，進(jìn)而生成成神經(jīng)細(xì)胞，成神經(jīng)細(xì)胞可逐漸發(fā)育為成熟神經(jīng)元細(xì)胞并部分遷移至海馬DG區(qū)GCL層，進(jìn)而影響神經(jīng)突觸形成和神經(jīng)傳導(dǎo)［20］。但MHT是否會增加TBI后海馬DG區(qū)神經(jīng)發(fā)生、并影響內(nèi)源性神經(jīng)可塑性，改善新生神經(jīng)元長期存活及成熟目前尚無定論。因此，為研究MHT對TBI海馬DG區(qū)神經(jīng)再生的影響，本實驗通過免疫熒光法檢測損傷側(cè)海馬DG區(qū)新生細(xì)胞（BrdU標(biāo)記）中成熟神經(jīng)元（NeuN標(biāo)記）的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在損傷后各時間點，TBI組和TBI+MHT組大鼠損傷側(cè)海馬DG區(qū)新生及成熟神經(jīng)元細(xì)胞均增加，且TBI+MHT組較TBI組增加更明顯，兩組新生神經(jīng)元細(xì)胞均從SGZ層逐漸向GCL層移位并逐漸成熟；且與損傷早期（1周）相比，損傷后期（4周及8周）TBI組成熟神經(jīng)元細(xì)胞減少，而TBI+MHT組則進(jìn)一步增加。這些都表明TBI僅能促進(jìn)腦創(chuàng)傷后新生神經(jīng)細(xì)胞的大量增殖及短期存活，而MHT可促進(jìn)TBI后海馬DG區(qū)新生神經(jīng)細(xì)胞的長期存活及成熟。

綜上所述，MHT可通過誘導(dǎo)顱腦創(chuàng)傷后新生神經(jīng)元細(xì)胞的長期存活及成熟來促進(jìn)TBI后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，為TBI內(nèi)源性治療提供潛在策略。