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    小麥紫色素的提取工藝、抗氧化活性及其在毛發(fā)染色中的應(yīng)用

    2018-07-26 05:43:48楊三維趙佳佳鄭興衛(wèi)蘆艷珍李劉軍張建誠
    生物技術(shù)進(jìn)展 2018年4期
    關(guān)鍵詞:麥麩色素小麥

    楊三維, 趙佳佳, 喬 玲, 鄭興衛(wèi), 蘆艷珍, 李劉軍, 張建誠*

    1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所, 山西 臨汾 041000;2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究中心, 太原 030031

    小麥(TriticumaestivumL.)是我國(guó)最重要的糧食作物之一,其籽粒顏色有白、紅、紫、深紫、藍(lán)、藍(lán)紫、黑紫等,其中,紫粒小麥?zhǔn)且蚍N皮紫色素積累而產(chǎn)生的。紫色素作為植物次生代謝物,是一類水溶性的類黃酮化合物,不僅具有鮮艷的顏色,而且具有較強(qiáng)的抗氧化作用,同時(shí),可預(yù)防心血管疾病等的發(fā)生,對(duì)人體具有一定的保健作用[1]。

    目前,飲料、食品等行業(yè)使用的著色劑大多為合成色素,而合成色素往往具有致癌、致突變等副作用,易對(duì)人體健康產(chǎn)生不良影響[2]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的提高和健康意識(shí)的加強(qiáng),食用天然原料的產(chǎn)品將會(huì)成為今后食品消費(fèi)的主流[3]。天然色素是最理想的著色劑,且具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥理作用。從植物中提取的紫色素安全、無毒,具有抗突變、抗氧化、降血壓、保護(hù)肝臟、預(yù)防癌癥、增加食品營(yíng)養(yǎng)成分和延長(zhǎng)保質(zhì)期的作用,主要用作食品的著色劑,如飲料、腌漬品、果凍、乳飲料、怡糖制品和保健品等[1,3]。近年來,隨著植物紫色素應(yīng)用范圍的不斷拓寬,對(duì)其的需求量急劇增長(zhǎng),日本和韓國(guó)都以高價(jià)收購植物紫色素用于醫(yī)藥和食品領(lǐng)域[4]。目前,植物紫色素主要是從紫薯、甘藍(lán)和紫玉米中分離提取,但這些方法多以新鮮植物為原材料,受季節(jié)的影響較大。而從紫粒小麥中提取天然紫色素,是以小麥麥麩為原料,成本較低、便于貯藏和運(yùn)輸,且不易受環(huán)境因素的影響。

    現(xiàn)階段,植物紫色素的提取主要采用酸堿抽提、超聲萃取等方法,但酸堿溶液分步提取法存在提取率低、活性差的缺點(diǎn),且酸堿液對(duì)后續(xù)的純化設(shè)備也會(huì)產(chǎn)生較大的損害[5]。同時(shí),也有利用超聲波和復(fù)合酶等方法提取色素的報(bào)道[6],具有周期短、得率高的特點(diǎn),但尚未應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。而已知的對(duì)于紫粒小麥種皮色素的組成及其含量的研究較少,且僅限于實(shí)驗(yàn)室水平,如利用酸化乙醇法提取紫色小麥麩皮色素[7],但在強(qiáng)酸性條件下提取,易導(dǎo)致色素變性,喪失生物學(xué)功能。在弱堿條件下提取植物色素的研究也有報(bào)道[5],但尚未應(yīng)用于小麥色素的提取。因此,尋找、開發(fā)高純度小麥紫色素的提取工藝具有重要意義。為了提升紫粒小麥的綜合利用價(jià)值,本文提供了1種高純度、低成本、便簡(jiǎn)化的小麥紫色素提取工藝,并研究了提取的小麥紫色素的抗氧化活性及其在毛發(fā)染色中的應(yīng)用,以期為小麥紫色素的生產(chǎn)應(yīng)用提供新方法和新思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1供試材料 選用目前推廣范圍較廣的2個(gè)品種:寧春46號(hào)、農(nóng)大3753,種植于本單位試驗(yàn)田,6月初正常成熟收獲。將2個(gè)品種1∶1混勻后進(jìn)行測(cè)定。

    1.1.2試驗(yàn)試劑: 濃鹽酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉和十六烷基三甲基溴化銨等化學(xué)試劑均為分析純,購自北京化工廠。魯米諾試劑購于上海寶曼生物科技有限公司。

    1.1.3試驗(yàn)儀器: WFJ-15型麥麩粉碎機(jī)(江蘇佳科機(jī)械有限公司);L(P)GZ型立式離心機(jī)(江蘇賽德力制藥機(jī)械制造有限公司);RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);UV2450型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);JP-200V型真空泵(海揚(yáng)真空設(shè)備有限公司);有機(jī)納濾膜(美國(guó)海德能公司);SP-1500型噴霧干燥器(上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);JY138型電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(法國(guó)Jobin Yvon Division公司);Z5000型原子吸收光譜儀(日本日立公司);LSC-LB7型液體閃爍儀(日本日立公司)。

    1.2 原料預(yù)處理

    用麥麩粉碎機(jī)將紫粒小麥麥麩粉碎,過300目篩,作為提取原材料于室溫干燥條件下貯藏備用。

    1.3 紫色素提取

    1.3.1堿水浸提,離心獲得粗提液 將粉碎后的細(xì)麥麩粉與1.5% NaOH溶液按1∶4(g/mL)的比例混合,充分?jǐn)嚢瑁S后每隔20 min攪拌1次,室溫條件下(25~30℃)提取1 h,然后用100目過濾器過濾。每份麥麩原料用以上方法分別浸提3次、過濾3次,最后將3次所得的濾液全部混合。

    將收集的混合濾液冷卻至10~12℃后,加入濃鹽酸,調(diào)節(jié)濾液pH至4,然后將濾液經(jīng)10 000 r/min離心10 min后棄沉淀,去除上清液中膜狀漂浮物后即獲得紫色素的粗提液。

    1.3.2紫色素的吸附解吸、離心濃縮 在pH 4的酸性環(huán)境下,用大孔吸附樹脂吸附粗提液中的紫色素,攪拌吸附2 h后過濾濾液,隨后利用濃度為60%~65%(V/V)的乙醇溶液解吸樹脂中已吸附的紫色素,解吸30 min后,過濾樹脂,得到洗脫液。將洗脫液倒入濾杯中,啟動(dòng)真空泵抽濾,使用耐乙醇的有機(jī)鈉濾膜對(duì)洗脫液進(jìn)行濃縮,得到體積濃縮至10%左右的濃縮液。

    1.3.3紫色素的蒸發(fā)濃縮 采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對(duì)濃縮液進(jìn)行蒸餾濃縮,設(shè)置真空度為0.9 MPa左右,使?jié)饪s后的體積達(dá)到原濃縮液體積的40%為止,再將蒸餾濃縮后的溶液經(jīng)10 000 r/min離心10 min后去除沉淀物,即得到紫色素提取液。

    1.3.4噴霧干燥 對(duì)得到的紫色素提取液進(jìn)行干燥處理,設(shè)定干燥器進(jìn)風(fēng)溫度為140℃,出風(fēng)溫度為60℃,采用電加熱補(bǔ)償輔助干燥,收集紫色素粉末后稱重,以色素重/麥麩重(g/kg)計(jì)算紫色素得率。

    1.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    以提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)為自變量,紫色素提取量為響應(yīng)值進(jìn)行單因素試驗(yàn)。具體參考鞠瑤瑤等[8]單因素試驗(yàn)優(yōu)化紫色素提取工藝的參數(shù)。

    1.5 紫色素純度和色價(jià)測(cè)定

    采用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)280~600 nm檢測(cè)紫色素純度,觀察吸收峰。取1 g紫色素干粉溶解于30 mL的30%乙醇溶液中,用pH 3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解并定容至100 mL,通過測(cè)定520 nm處的吸光值(A)計(jì)算色價(jià)值。吸光值在0.2~0.8之間為有效數(shù)據(jù),以pH 3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液為對(duì)照,色價(jià)Ecm%=A×稀釋倍數(shù)。

    1.6 紫色素抗氧化活性檢測(cè)

    在含有H2O2的魯米諾發(fā)光體系中,檢測(cè)不同濃度小麥紫色素對(duì)活性氧的清除率,進(jìn)而計(jì)算其IC50(IC50是指清除率為50%時(shí)所需的紫色素濃度)。在測(cè)定瓶中依次加入100 μL 5 mol/L H2O2和500 μL 0.2 mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(pH 9.7),再分別加入0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.7 mg/mL、0.9 mg/mL和0.95 mg/mL的小麥紫色素,將雙蒸水作為空白對(duì)照;混合均勻后加入5 mol/L魯米諾和10 mol/L十六烷基三甲基溴化銨的等量混合液(500 μL)以啟動(dòng)反應(yīng),隨后置于液閃測(cè)定儀中,延時(shí)10 s,測(cè)定12 s內(nèi)的發(fā)光強(qiáng)度。按照下式計(jì)算清除率:

    清除率=(空白對(duì)照值-樣品值)/空白對(duì)照值×100%

    1.7 紫色素重金屬含量檢測(cè)

    采用電感耦合等離子體(inductively coupled plasma,ICP)-原子發(fā)射光譜儀和原子吸收光譜儀檢測(cè)色素提取物中的重金屬含量。元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)溶液(NCS)稀釋而成,試驗(yàn)用水為去離子水。ICP分析條件:譜線波長(zhǎng)As=193.7 nm,工作功率1 250 W,入射狹縫18 nm,出射狹縫79 nm,進(jìn)樣速率1.5 mL/min,載氣壓力0.25 MPa,護(hù)套氣量0.18 L/min,冷卻氣流量18 L/min。原子吸收分析條件:燈電流7.5 mA,狹縫1.3 nm,燃燒器高度7.5 mm,火焰類型為貧燃。提取物中金屬總含量通過比色法測(cè)定,按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《有機(jī)化工產(chǎn)品中重金屬的測(cè)定》(GB/T 7532-2008)進(jìn)行[9]。

    1.8 紫色素羊毛染色

    將洗凈的白色羊毛放入0.1 mol/L Na2CO3預(yù)處理液中,靜置10 min,再分別在0.08 mol/L的MgSO4、FeSO4、AlCl3和FeCl3金屬離子媒染劑中處理10 min后洗凈,最后放入濃度為3 g/L的紫色素溶液中染色10 min,觀察其顏色變化。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 小麥紫色素提取工藝的優(yōu)化

    在小麥紫色素的提取過程中,影響其得率的因素主要為提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)和料液比。為保持紫色素的化學(xué)穩(wěn)定性,在室溫條件(25~30℃)下對(duì)紫色素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。以提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)為自變量,紫色素提取量為響應(yīng)值進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

    當(dāng)料液比為1∶3(g/mL)時(shí),隨著提取時(shí)間延長(zhǎng),紫色素得率增加;當(dāng)提取時(shí)間超過60 min后,紫色素得率開始呈下降趨勢(shì)(圖1A)。這可能是由于提取時(shí)間過長(zhǎng),原材料組織中大量的細(xì)胞破裂,細(xì)胞內(nèi)大量不溶物及黏性物質(zhì)混入提取液中,導(dǎo)致提取液中雜質(zhì)增多、黏度增強(qiáng),反而影響了紫色素的溶出;另一方面,隨著提取時(shí)間延長(zhǎng),紫色素的多糖分子鏈C6-C3-C6骨架斷裂,導(dǎo)致其在后續(xù)醇沉處理過程中損失增大,降低了紫色素得率[8],由此確定紫色素的最佳提取時(shí)間為60 min(圖1A)。

    在提取時(shí)間為60 min的條件下,麥麩粉與1.5% NaOH溶液以不同比例混合進(jìn)行提取(圖1B),隨著1.5% NaOH溶液用量的增加,紫色素得率也明顯提高,原因可能是溶劑比例的增加可有效降低溶液的黏度,提高了濃度差,有利于紫色素分子的擴(kuò)散 ;而進(jìn)一步增加料液比使粗提液中色素濃度降低,導(dǎo)致后續(xù)大孔吸附樹脂吸附率降低,可見,料液比為1∶4(g/mL)時(shí),麥麩紫色素的提取效果較為理想。

    圖1 不同條件對(duì)紫色素提取率的影響Fig.1 Effects of different factors on the yield of purple pigment.

    在料液比1∶4(g/mL)、提取時(shí)間60 min的條件下,進(jìn)一步研究了提取次數(shù)對(duì)紫色素得率的影響,從圖1C中可以看出,隨著提取次數(shù)的增加,紫色素得率升高,但提取次數(shù)超過3次后,得率呈下降趨勢(shì)。最后,于室溫條件(25~30℃)下,采用優(yōu)化后提取條件:提取時(shí)間60 min、料液比1∶4(g/mL)、提取3次,提取的紫色素得率為3.11 g/kg。

    2.2 小麥紫色素紫外光譜分析

    紫色素為糖配體,分子量較大,易導(dǎo)致提取物中含有大量的多糖、蛋白質(zhì)和淀粉,從而極大地限制了紫色素的應(yīng)用。從圖2中可以看出,提取的紫色素樣品在310~355 nm處和520~540 nm處,出現(xiàn)了與花青素和花色苷一致的較強(qiáng)吸收峰。其中,310~355 nm處花青素酰基結(jié)構(gòu)的特征峰峰位顯著,表明本研究提取的紫色素純度較高。此外,經(jīng)計(jì)算,小麥紫色素色價(jià)為91。

    2.3 小麥紫色素相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

    為了明確紫色素中的重金屬含量,先采用比色法測(cè)定總金屬含量,再利用原子吸收光譜儀和離子體原子發(fā)射光譜儀測(cè)定鉛和砷等物質(zhì)的含量。檢測(cè)結(jié)果見表1,重金屬總含量小于24 μg/g,遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(40 μg/g);鉛和砷等毒性較大的金屬離子均未檢出;干燥失重僅為5.9%,灰分成分為2.1%,各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到了商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)[9,10]。植物色素大多從植物根莖、葉片等組織提取,這類組織為植物代謝的主要器官,次級(jí)代謝產(chǎn)物和酶的含量往往較高,常導(dǎo)致色素中含有較多重金屬。而本工藝是以麥麩為原料,提取種皮中累積的色素,因此重金屬含量較低。

    圖2 紫色素紫外圖譜掃描曲線Fig.2 Scanning curve of ultraviolet spectrum of purple pigment.

    表1 紫色素提取物性質(zhì)檢測(cè)Table 1 The property of purple pigment.

    2.4 小麥紫色素抗氧化活性評(píng)價(jià)

    在含有H2O2的魯米諾發(fā)光體系中加入小麥紫色素后,體系的發(fā)光強(qiáng)度降低,表明紫色素具有清除活性氧的作用;隨著加入的紫色素濃度的升高,對(duì)活性氧的清除率也有所上升。以清除率對(duì)紫色素濃度作圖(圖3),可得小麥紫色素的IC50為1.436 g/L,表明小麥紫色素具有較強(qiáng)的清除H2O2的能力,即具有較高的抗氧化活性。

    2.5 小麥紫色素羊毛染色

    針對(duì)小麥紫色素應(yīng)用的研究開展較少,未見其用于毛發(fā)染色的報(bào)道。本工藝提取的小麥紫色素具有較高的純度和色價(jià),羊毛染色結(jié)果表明,紫色素與不同金屬元素作用可將羊毛染成不同顏色(圖4,彩圖見圖版四):MgSO4-紫色素顯紫紅色,F(xiàn)eSO4-紫色素顯淡黃色,AlCl3-紫色素顯深藍(lán)色,F(xiàn)eCl3-紫色素顯棕黑色。

    圖3 不同質(zhì)量濃度對(duì)活性氧的清除作用Fig.3 The scavenging effects on active oxygenic of purple pigment with different concentration.

    圖4 紫色素羊毛染色樣品Fig.4 Purple pigment applied to dyeing wool.

    3 討論

    從紫粒小麥中提取的天然色素對(duì)人類安全無毒,且具有較強(qiáng)的著色性和穩(wěn)定性,可直接用于食品、化妝品等行業(yè)[10~13]。同時(shí),研究表明,小麥紫色素具有預(yù)防心腦血管疾病以及抗癌的作用[1,4]。目前,紫粒小麥種植面積逐年增加,主要用來加工面粉。雖然富含紫色素的麥麩產(chǎn)量大,但利用率較低,基本都用作動(dòng)物飼料,造成了原料的廉價(jià)消耗[2,4]。常見的小麥紫色素提取方法為酸堿抽提法,如唐曉珍等[7]采用酸化乙醇浸提法,提取的紫色小麥紫色素得率為(0.87±0.21)g/kg,高建偉等[14]使用酸性甲醇浸提以及孫群[15]與李杏普等[16]等使用酸性水浸提;也有利用超聲波法、微生物降解、酶法、微生物纖維素菌細(xì)胞破壁法以及高溫提取的研究[17~20],如傅虹飛等[21]利用超聲波輔助提取,提取的小麥紫色素得率為(1.82±0.23)g/kg,是普通浸提法的2倍。但由于麥麩中含有較多的淀粉和蛋白質(zhì),加之酸堿裂解,導(dǎo)致提取的紫色素活性較低,極大的限制了小麥紫色素的開發(fā)和利用。本文采用將堿水裂解與大孔樹脂吸附、有機(jī)鈉濾膜濃縮相結(jié)合的方法,使小麥紫色素得率提高為3.11 g/kg,高于之前已有方法,為小麥紫色素的進(jìn)一步利用奠定了基礎(chǔ)。在抗氧化活性方面,張立偉等[22]發(fā)現(xiàn)連翹活性物質(zhì)對(duì)活性氧具有較強(qiáng)的清除能力,而本工藝提取的小麥紫色素對(duì)H2O2清除能力高于連翹皂甙(1.618 g/L)。此外,金屬元素分析結(jié)果表明,提取的小麥紫色素重金屬含量較低,達(dá)到了國(guó)家食品藥品的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。綜上所述,本工藝提取的小麥紫色素的體外抗氧化活性高、重金屬含量低,在抗氧化功能性食品或功能因子添加劑方面具有較大的開發(fā)潛力。

    目前,毛發(fā)染色劑已成為美妝領(lǐng)域較流行的產(chǎn)品,傳統(tǒng)永久型染發(fā)劑的染料中間體一般采用具有毒性的苯二胺及其衍生物,而有毒染料正逐漸退出市場(chǎng)。法國(guó)、英國(guó)等歐洲國(guó)家已研制出以蘇木精為原料的植物染發(fā)劑,日本也有市售的辣椒素、單寧酸、胭脂紅酸等植物天然毛發(fā)染色劑[23,24]。在我國(guó)歷來就有利用何首烏、蘇木精和胡桃醌等天然色素進(jìn)行染發(fā)的傳統(tǒng),均是基于紫色素可與多種金屬元素結(jié)合顯色的原理。本文以羊毛為原材料,通過不同金屬元素與紫色素作用對(duì)羊毛進(jìn)行染色,結(jié)果表明小麥紫色素具有作為染發(fā)劑的可行性,進(jìn)一步拓寬了小麥紫色素的應(yīng)用和研究范圍。

    植物多酚是一種源于綠色植物的生物質(zhì)材料,現(xiàn)已逐漸成為研究熱點(diǎn),其能夠與生物大分子作用、同時(shí)又可與金屬離子作用而顯色,為植物多酚染料奠定了基礎(chǔ)。多酚染料常常采用媒染工藝,常以金屬離子作為媒染劑,目前關(guān)于金屬離子用于媒染的機(jī)理研究較為深入,但金屬離子、多酚及毛纖維相互作用的規(guī)律和關(guān)系尚不清楚,因而,進(jìn)一步揭示三者間的作用機(jī)理是天然染料的研究與應(yīng)用的關(guān)鍵所在。

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