氫分子對宮頸癌細(xì)胞HeLa的影響

商 蕾, 李佳臘, 蘇澤華, 謝 飛, 馬雪梅

北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院, 北京氫分子研究中心, 北京 100124

全球范圍內(nèi)宮頸癌發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，占所有女性惡性腫瘤發(fā)病的13%，居?jì)D科惡性腫瘤發(fā)病率首位。在我國，每年約有13萬新發(fā)宮頸癌患者，年發(fā)病率占全球總數(shù)的28%以上。它已成為15～44歲年齡段女性惡性腫瘤發(fā)病第二的疾病，且越來越趨向年輕化[1]。目前，宮頸癌的治療主要采用手術(shù)、化療、放療綜合治療的方法，有效的化療能提高治愈率，降低復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)在基因治療[2]、生物靶向治療[3]、熱療[4]以及介入治療[5]等新技術(shù)方法逐步應(yīng)用于宮頸癌患者的治療當(dāng)中后，宮頸癌患者的生存率和生活質(zhì)量也在逐漸提高和改善。2008年，Saitoh等[6]在實(shí)驗(yàn)中研究中性pH富氫電解水對腫瘤細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)氫分子可以顯著降低人舌癌細(xì)胞HSC-4的細(xì)胞克隆形成率(72%)以及克隆細(xì)胞數(shù)(66%)，并且不影響正常細(xì)胞的增殖。與傳統(tǒng)抗腫瘤化療藥物相比，氫分子對人體十分安全。傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物為多靶向藥物，存在一定的副作用，會(huì)降低患者的生活質(zhì)量，現(xiàn)有結(jié)果表明，氫分子的使用是安全無毒的[7]。其次，不同于其他抗腫瘤物質(zhì)和藥物，氫氣本身結(jié)構(gòu)非常簡單，代謝產(chǎn)物也簡單安全，例如氫氣與羥自由基反應(yīng)可以生成水，而多余的氫氣則可以通過呼吸排出體外。再者，一般的抗腫瘤藥物需要通過消化道吸收等過程，達(dá)到其血藥峰值的時(shí)間較長，而氫分子在體內(nèi)能夠快速擴(kuò)散到需要保護(hù)或治療的組織，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到濃度峰值。最后，氫分子給藥方式多樣，它可通過不同的給藥方式發(fā)揮治療作用，如呼吸氫氣、飲用富氫水、注射飽和氫生理鹽水等方式，目前都有相關(guān)研究[8]。本研究采用含氫培養(yǎng)基對人宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行處理，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢驗(yàn)細(xì)胞遷移和侵襲的能力，研究氫分子對細(xì)胞的影響，從而為氫分子預(yù)防和治療宮頸癌、提高宮頸癌病人的生存率以及改善生活質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

氫水棒購于水素水科技發(fā)展有限公司；DMEM(高糖)培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)、青鏈霉素(100X)、0.25%Trypsin-EDTA、B27、EGF和bFGF購于美國Gibco公司；細(xì)胞周期和凋亡檢測試劑盒購于美國Millipore公司；Matrigel基質(zhì)膠購于美國BD公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、離心管、Transwell培養(yǎng)小室等購于美國Corning公司；人宮頸癌細(xì)胞系HeLa來自北京同為時(shí)代生物科技有限公司；CCK-8購于東仁化學(xué)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1含氫培養(yǎng)基的制備 將滅菌后的氫水棒放入培養(yǎng)基中，密封瓶口，待2 d氫氣達(dá)到飽和后使用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) HeLa細(xì)胞株在氮中保存，需要復(fù)蘇時(shí)取出，立即置于37℃的水浴鍋中，輕輕晃動(dòng)凍存管使其內(nèi)凍存的細(xì)胞液迅速融化，之后將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至含有10倍體積新鮮DMEM培養(yǎng)基的15 mL離心管中，混合后于離心機(jī)中800 r/min 離心5 min后棄上層培養(yǎng)液，加入1～2 mL含10%FBS的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將HeLa細(xì)胞接種于含4～6 mL的普通培養(yǎng)基的25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、飽和濕度、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，按1∶3～1∶5進(jìn)行傳代。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組時(shí)，分為對照組(CK)和含氫培養(yǎng)組(HM)。

1.2.3細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 采用臺(tái)盼藍(lán)染料浸染細(xì)胞來進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。使用前用無水乙醇清潔計(jì)數(shù)板和蓋玻片，然后用吸水紙輕輕擦干，將蓋玻片覆蓋在計(jì)數(shù)板上；用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，吸取10 μL左右待測細(xì)胞懸液至1.5 mL離心管中，稀釋一定倍數(shù)，再加入等體積的0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染液混勻，靜置約1～2 min；將混合液混合均勻，吸取少量液體從計(jì)數(shù)板一側(cè)邊緣緩緩滴入，使混合液充滿計(jì)數(shù)板和蓋玻片之間的空隙，注意加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡，在細(xì)胞加入到血球計(jì)數(shù)板后，稍后片刻置于顯微鏡下觀察，在低倍鏡下(10×10倍)觀察計(jì)數(shù)；用計(jì)數(shù)器來計(jì)算計(jì)數(shù)板四角的4個(gè)大方格中的活細(xì)胞數(shù)目，按公式細(xì)胞濃度(個(gè)/mL)=(4個(gè)方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)/4)×2×104×稀釋倍數(shù)來計(jì)算細(xì)胞的濃度。

1.2.4克隆球形成實(shí)驗(yàn) 收集對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用無血清DMEM/F12普通培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液至2×103/mL。六孔板中按CK和HM組分別加入2 mL 無血清培養(yǎng)基(加入1× B27、20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF)，每孔加入500個(gè)細(xì)胞，之后放于37℃、含5% CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)情況每隔3 d適當(dāng)添加培養(yǎng)液，培養(yǎng)7～10 d。待形成明顯的克隆球停止實(shí)驗(yàn)，將六孔板放置在倒置顯微鏡下觀察，在低倍鏡下(40×)計(jì)數(shù)直徑大于50 μm的克隆球，隨機(jī)拍攝5張克隆球照片，使用顯微鏡拍照軟件測量克隆球直徑。

1.2.5克隆形成實(shí)驗(yàn) 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞吹打懸浮在含10%FBS的培養(yǎng)液中備用。然后將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，以每皿50、100、200個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種于含8～10 mL的37℃預(yù)溫DMEM培養(yǎng)液的小皿中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使細(xì)胞分散均勻。放置于37℃、飽和濕度、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d左右。每3天左右進(jìn)行觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng)。棄去上清培養(yǎng)液，用PBS溶液輕輕浸洗2次。再用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15 min。棄去固定液，加適量結(jié)晶紫染色液染細(xì)胞2～3 min左右，用流水緩慢洗去染色液，然后空氣干燥。將平皿倒置，用肉眼直接計(jì)克隆數(shù)，或在顯微鏡(低倍鏡40×)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，在低倍鏡下隨機(jī)拍攝5張平板克隆照片，使用顯微鏡拍照軟件測量克隆直徑。

1.2.6細(xì)胞活性測定(CCK-8法) 取處于對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104/mL，以每孔100 μL細(xì)胞量接種于96孔板，共接種60孔。置于37℃、飽和濕度、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組每孔換普通培養(yǎng)基或者含氫培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)0 h、6 h、24 h、48 h、72 h。在每個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)每孔加10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)1 h。使用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測吸光度OD值。根據(jù)公式計(jì)算平均抑制率，確定氫分子對HeLa細(xì)胞活性的影響。

細(xì)胞存活率(%)= [(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%

As:試驗(yàn)孔(含細(xì)胞、含氫培養(yǎng)基、CCK-8)；Ac:對照孔(含細(xì)胞、普通培養(yǎng)基、CCK-8)；Ab:空白孔(不含細(xì)胞、普通培養(yǎng)基、CCK-8)

1.2.7細(xì)胞免疫熒光 收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用全血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液至5×104/mL，5萬細(xì)胞每孔接種于6孔板中的細(xì)胞玻片上。置于37℃、飽和濕度、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組每孔更換普通培養(yǎng)基或者含氫培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出6孔板，加入PBS洗2次，4%多聚甲醛室溫固定15 min。吸掉孔中多聚甲醛，PBS常溫洗2次，加入新鮮稀釋的0.3%的Triton X-100通透10 min。吸掉通透液，PBS洗1遍，滴加10%山羊血清工作液，室溫封閉30 min。吸去山羊血清，加入1∶200稀釋的anti-Vimentin抗體(空白對照加入PBS，實(shí)驗(yàn)組加入抗體)，4℃濕盒中孵育過夜。取出濕盒，恢復(fù)至室溫，小心吸掉一抗，PBS洗3次，每次5 min。加入1:500稀釋的熒光二抗，室溫避光孵育1 h。PBS避光洗3次，每次5 min，滴加Hoechst進(jìn)行核染色5 min，PBS洗1遍，取出細(xì)胞玻片，熒光顯微鏡下觀察并在40× 鏡下拍照。

1.2.8細(xì)胞周期檢測 收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用全血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液至2×105/mL，20萬細(xì)胞每孔接種于6孔板中。置于37℃、飽和濕度、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，根據(jù)分組每孔換成普通培養(yǎng)基或者含氫培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出6孔板，將培養(yǎng)基收集在15 mL離心管中，PBS溶液清洗2次后收集細(xì)胞，用500 μL PBS溶液重懸，逐滴加入到10 mL 70%的冰乙醇中，置于冰箱4℃過夜。取出固定后的細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，去掉固定液，PBS洗2次，加入200 μL 細(xì)胞周期檢測試劑，室溫避光反應(yīng)20 min后，流式檢測。

1.2.9細(xì)胞凋亡檢測 收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用全血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液至2×105/mL，20萬細(xì)胞每孔接種于6孔板中。置于37℃、飽和濕度、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，根據(jù)分組每孔換普通培養(yǎng)基或者含氫培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出6孔板，將培養(yǎng)基收集在15 mL離心管中，PBS洗2次，收集細(xì)胞后使用1 mL含有1%FBS的PBS洗2遍，離心后用100 μL含有1%FBS的PBS重懸，加入100 μL細(xì)胞凋亡檢測試劑，室溫避光反應(yīng)15 min后，流式檢測。

1.2.10細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)期生長的細(xì)胞，細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，每孔50萬細(xì)胞接入6孔板，于37℃、含5% CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間，待細(xì)胞長滿板底后，用200 μL的黃槍頭垂直于孔板沿直線制造細(xì)胞劃痕，盡量使每個(gè)劃痕的寬度一致。輕輕吸走培養(yǎng)液，用PBS溶液緩慢沖洗孔板3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。然后分組加入1%FBS的普通培養(yǎng)基和含氫培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在劃痕后的0 h、24 h拍照記錄。盡量在同一位置拍照。根據(jù)收集的圖片數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.11細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 首先進(jìn)行基質(zhì)膠鋪板：將Matrigel膠用無血清無雙抗的培養(yǎng)基1∶6稀釋，取50～100 μL包被Transwell小室底部膜的上室面(小心滴加，不能產(chǎn)生氣泡)，置于37℃ 孵育30 min左右，使Matrigel聚合成凝膠。使用前先進(jìn)行基底膜水化。凝膠時(shí)可以制備HeLa細(xì)胞懸液：取處于對數(shù)期的細(xì)胞消化，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用1 mL PBS溶液洗1～2次，再用含有1% FBS的培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至3.5×105/mL(制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞去血清饑餓12～24 h，去除血清的影響，但這一步非必須)。接種細(xì)胞：24孔板下室加入650 μL含10%FBS的培養(yǎng)基，Transwell上層小室均勻地輕輕加入300 μL細(xì)胞懸液(需注意下層培養(yǎng)液和小室間不要有氣泡產(chǎn)生，否則會(huì)使下層培養(yǎng)液的趨化作用減弱甚至消失，故在種板時(shí)要留心，如果出現(xiàn)氣泡，將小室提起去除氣泡，再將小室放回培養(yǎng)板即可)。將培養(yǎng)板小心地放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出小室，棄去孔中培養(yǎng)液，PBS溶液洗2次后用4%多聚甲醛室溫固定20 min，將小室適當(dāng)風(fēng)干，放在500 μL 0.1%結(jié)晶紫染色液的孔中，染色20 min左右，用棉簽輕輕擦掉上層未浸潤的細(xì)胞，PBS溶液洗2次。 進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)：在100倍顯微鏡下觀察細(xì)胞并隨即拍下5個(gè)視野(一般采用左上、左下、右上、右下、中央5個(gè)視野)，記數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)采用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 6.01分析所有數(shù)據(jù)資料。在符合正態(tài)性和方差齊性的前提下，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述；統(tǒng)計(jì)推斷則采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氫分子對HeLa細(xì)胞懸浮克隆球形成的影響

本實(shí)驗(yàn)無血清方法培養(yǎng)懸浮克隆球，通過在培養(yǎng)基中添加氫分子，探討氫分子對細(xì)胞克隆球形成的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 氫分子對細(xì)胞懸浮克隆球生長的影響(4×)Fig.1 Effect of molecular hydrogen on suspension cloning ball change of HeLa cell(4×).

圖1表示氫分子對HeLa細(xì)胞克隆球形成的情況。圖1A是培養(yǎng)板中HeLa細(xì)胞形成克隆球的情況，發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞無明顯克隆球形成，但是可以形成細(xì)胞集落，加入含氫培養(yǎng)基后，細(xì)胞集落數(shù)量明顯變少；圖1B和圖1C為接種細(xì)胞形成細(xì)胞集落的計(jì)數(shù)圖和平均直徑圖，由圖1可以看出，加入氫分子后，細(xì)胞集落數(shù)量顯著減少，同時(shí)細(xì)胞集落直徑明顯變小(P<0.001)，說明氫分子對HeLa細(xì)胞的克隆球形成有抑制作用。

2.2 氫分子對HeLa細(xì)胞克隆球形成的變化

細(xì)胞克隆形成率可以檢測細(xì)胞接種后貼壁的細(xì)胞成活并能夠形成克隆的數(shù)量，已有研究證實(shí)，細(xì)胞貼壁后不一定都能增殖并且形成克隆，而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞，克隆形成率是反映一種細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀的常用實(shí)驗(yàn)方法。本研究采用平板克隆實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)氫分子對貼壁后的細(xì)胞形成克隆能力的影響，從而研究氫分子對腫瘤成瘤率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 氫分子對細(xì)胞克隆形成的影響Fig.2 Effect of molecular hydrogen on clone formation.

圖2表示氫分子對HeLa細(xì)胞的克隆形成的影響，圖2A為部分細(xì)胞長成的單克隆形成數(shù)量，加入含氫培養(yǎng)基后，HeLa細(xì)胞的克隆形成數(shù)顯著減少(P<0.001)；圖2B和圖2C為接種細(xì)胞形成克隆的計(jì)數(shù)圖和細(xì)胞形成克隆的平均直徑大小圖，結(jié)果表明，氫分子能夠顯著抑制HeLa細(xì)胞的克隆形成數(shù)量，且由圖中可得，HeLa細(xì)胞克隆直徑在加入氫分子后顯著減小。這些結(jié)果說明氫分子可能抑制HeLa細(xì)胞的克隆形成，對抑制癌癥的生長可能具有一定的作用效果。

2.3 含氫培養(yǎng)基對HeLa細(xì)胞生長速率和形態(tài)學(xué)變化的影響

本實(shí)驗(yàn)采用含氫培養(yǎng)基處理HeLa細(xì)胞不同時(shí)間段，CCK-8法檢測氫分子對不同細(xì)胞活性的作用，本實(shí)驗(yàn)只監(jiān)測了細(xì)胞72 h內(nèi)的增殖情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖3、圖4(彩圖見圖版一)所示。

圖3表示氫分子對HeLa細(xì)胞生長的作用。與CK組相比，氫分子處理細(xì)胞后，HeLa細(xì)胞在前24 h內(nèi)的生長受到明顯抑制，HM組細(xì)胞增殖速率明顯低于CK組；48 h內(nèi)HM組增殖速率保持與CK組相同，隨后HM組細(xì)胞的增殖速率高于CK組，但在72 h內(nèi)細(xì)胞的活性始終低于CK組。結(jié)果表明氫分子能在一定程度上抑制細(xì)胞的生長。

圖4表示氫分子對HeLa細(xì)胞波形蛋白表達(dá)變化的影響。波形蛋白(vimentin)是細(xì)胞中間絲的一種，從細(xì)胞核到細(xì)胞膜呈放射狀分布，在維持和調(diào)節(jié)細(xì)胞功能中起著非常重要的作用，其參與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、分化以及細(xì)胞凋亡等過程，有研究表明，波形蛋白的表達(dá)與細(xì)胞增殖能力、粘附能力以及遷移和侵襲能力成正相關(guān)。氫分子處理HeLa細(xì)胞后，少部分細(xì)胞扁圓，細(xì)胞密度降低，細(xì)胞變小，波形蛋白表達(dá)量減少。這表明氫分子可引起中間絲波形蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的粘附和細(xì)胞形態(tài)。

2.4 含氫培養(yǎng)基引起HeLa細(xì)胞周期和凋亡的變化

本實(shí)驗(yàn)采用不同培養(yǎng)基處理HeLa細(xì)胞24 h，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及不同時(shí)期細(xì)胞凋亡的變化，探討氫分子對腫瘤細(xì)胞周期和凋亡的影響，結(jié)果如圖5表示。

圖5表示氫分子對HeLa細(xì)胞周期和凋亡的影響及其柱狀圖，可以看出HeLa細(xì)胞的G0/G1時(shí)期細(xì)胞數(shù)量有減少的趨勢，但與對照組相比并無顯著差異，S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少，且G2/M期細(xì)胞顯著增加。因此，氫分子處理HeLa細(xì)胞后，可能通過減少S期分裂以及G2/M期阻滯影響細(xì)胞周期；且與CK組相比，HeLa細(xì)胞在氫分子處理后，只有晚期凋亡細(xì)胞有增加的趨勢，說明氫分子處理對HeLa細(xì)胞的主要作用可能是促進(jìn)其晚期凋亡。

圖3 氫分子對HeLa細(xì)胞生長速率的影響Fig.3 Effect of molecular hydrogen on growth rate of HeLa cell.

圖4 氫分子對HeLa細(xì)胞波形蛋白的影響(40×)Fig.4 Effect of molecular hydrogen on vimentin expression of HeLa cell(40×).(彩圖見圖版一)

2.5 含氫培養(yǎng)基對HeLa細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞遷移是機(jī)體正常生長發(fā)育的生理過程，是正常細(xì)胞的基本功能之一，也是活細(xì)胞普遍存在的一種運(yùn)動(dòng)形式。癌癥轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的遷移能力息息相關(guān)。本研究采用劃痕實(shí)驗(yàn)，加入含氫培養(yǎng)基處理HeLa細(xì)胞，觀察0 h和24 h時(shí)細(xì)胞遷移的情況，進(jìn)而觀察氫分子對腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6表示氫分子對HeLa細(xì)胞遷移的影響。經(jīng)過24 h的培養(yǎng)，細(xì)胞開始向中間移動(dòng)，加入氫培養(yǎng)基后，HeLa細(xì)胞的遷移能力顯著降低(P<0.001)。結(jié)果表明氫分子對HeLa細(xì)胞的遷移具有一定的抑制作用。

2.6 含氫培養(yǎng)基引起HeLa細(xì)胞浸潤的變化

腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(tumour invasion assay)主要用于研究惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響因素和機(jī)制。本研究采用Transwell實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞侵襲，加入含氫培養(yǎng)基處理細(xì)胞系，觀察細(xì)胞浸潤的情況，從而觀察氫分子對HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7(彩圖見圖版一)所示。

圖5 氫分子對HeLa細(xì)胞周期和凋亡的影響Fig.5 Effect of molecular hydrogen on cell cycle and apoptosis of HeLa cells.

圖6 氫分子對HeLa細(xì)胞遷移的影響Fig.6 Effect of molecular hydrogen on cell migration of HeLa cells.

圖7表示氫分子HeLa細(xì)胞的侵襲結(jié)果，圖7A為穿過Transwell小室基底膜的細(xì)胞顯微鏡下的結(jié)果，染色越深說明細(xì)胞穿過基底膜的數(shù)量越多；圖7B為穿過小室的細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，加入含氫培養(yǎng)基后，HeLa細(xì)胞的穿孔細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，說明氫分子可能抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲，對抑制癌癥的轉(zhuǎn)移具有一定的效果。

圖7 氫分子對細(xì)胞浸潤的影響Fig.7 Effect of molecular hydrogen on cell invasion.

3 討論

對于宮頸癌，總的治療原則是以手術(shù)和放療為主、化療為輔的綜合治療方法，目的是為了提高盆腔的局部控制率，降低術(shù)后的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，進(jìn)而增加患者的5年生存率。近年來，大量循證醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，同步放化療可以降低宮頸癌局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率，改善患者生活質(zhì)量，延長患者生存時(shí)間，目前已被美國國立癌癥研究所推薦為宮頸癌治療標(biāo)準(zhǔn)[3]。藥物療法和放射治療雖然是癌癥治療的重要手段，但是化療藥物的針對性較弱，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也在不同程度上損傷了正常的組織和細(xì)胞，易導(dǎo)致人體不同程度的不良反應(yīng)。放射治療過程中產(chǎn)生較多的活性氧，導(dǎo)致患者的氧化應(yīng)激和炎癥水平升高[9]，引起較多副作用，易導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降?，F(xiàn)有研究證明，氫分子與放化療聯(lián)合使用，能夠在不影響放化療療效的基礎(chǔ)上提高化療藥物的作用效果并減少放化療過程中的副作用。臨床上，楊慶璽[10]對多種癌癥患者進(jìn)行對照研究，飲用富氫水對惡性腫瘤病人有減毒增效的作用。通過讓化療患者在服藥期間飲用15 d富氫水，他們發(fā)現(xiàn)富氫水對包括肺癌、胃癌、大腸癌、乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥患者化療的副作用均有所降低，能夠保護(hù)骨髓，保護(hù)胃腸道、肝腎、心肌功能，改善化療后引起的體能下降等情況。這些結(jié)果顯示出氫分子在減輕化療副作用、提高藥效和改善患者生活質(zhì)量方面具有較好的潛在應(yīng)用價(jià)值。富氫水有潛力通過有效地減輕化療藥物的副作用，提高化療過程中患者的生活質(zhì)量。Kang等[11]通過讓放療期間肝癌患者飲用6周富氫氣水，顯著降低了肝癌患者血液中活性氧的代謝產(chǎn)物，維持了血液中的氧化電勢，患者的生活質(zhì)量評分顯著提高，同時(shí)兩組患者的腫瘤本身的反應(yīng)未發(fā)現(xiàn)不同，因此說明氫分子可以通過減少輻射誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)來減少放射治療的副作用。

本研究從氫分子單獨(dú)處理HeLa細(xì)胞的角度來觀察，發(fā)現(xiàn)氫分子可以改變細(xì)胞形態(tài)，抑制其增殖、遷移和侵襲能力，影響細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而說明氫分子能夠抑制腫瘤的生長和癌癥的轉(zhuǎn)移，對宮頸癌的發(fā)生發(fā)展可能具有防治作用。且氫分子價(jià)格低廉，獲得容易，安全無毒。從安全性和經(jīng)濟(jì)性的角度來看，氫分子很可能成為腫瘤治療及預(yù)防的一種良好的輔助性手段，且極具應(yīng)用前景。采用呼吸氫氣、引用富氫水等相關(guān)健康產(chǎn)品或許可以作為臨床上癌癥預(yù)防的新方法和腫瘤治療的新手段。