CO2濃度升高對(duì)不同秋眠型苜蓿葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

杜樂山，劉海燕，翟曉朦，任夢(mèng)云，李俊生，關(guān) 瀟

(中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院國(guó)家環(huán)境保護(hù)區(qū)域生態(tài)過程與功能評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012)

自工業(yè)革命以來，隨著大量伐木毀林以及化石燃料的燃燒，大氣層中CO2濃度日益增高，已由工業(yè)革命前的280 μmol·mol-1增加到如今的370 μmol·mol-1，并以每年1.8 μmol·mol-1的速度迅速增加[1]。預(yù)計(jì)到21世紀(jì)中期，大氣中的CO2濃度將達(dá)到550 μmol·mol-1[2]；到21世紀(jì)末，CO2濃度將增至421～936 μmol·mol-1[3]。作為植物光合作用和初級(jí)代謝的基本物質(zhì)，CO2濃度升高是全球氣候變化中極少數(shù)對(duì)農(nóng)作物生產(chǎn)力有正向因子的作用之一[4]，對(duì)植物表型特征、光合作用、生理生化乃至繁殖等均有顯著影響。植物葉片是植物進(jìn)化過程中對(duì)環(huán)境變化較敏感的器官，其解剖結(jié)構(gòu)最能體現(xiàn)環(huán)境因子對(duì)植物的影響[5]及植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)策略[6-8]，因此，研究CO2濃度升高對(duì)植物葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響尤為重要。

苜蓿(Medicagosativa)是多年生豆科植物，具有適應(yīng)性強(qiáng)、草質(zhì)優(yōu)良、營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，被譽(yù)為“牧草之王”。秋眠性是苜蓿的重要特性，北美科學(xué)家先后根據(jù)秋眠類型將苜蓿劃分為9個(gè)和11個(gè)等級(jí)。秋眠型苜蓿秋季刈割后再生速度慢，產(chǎn)量較低，抗寒性強(qiáng)；非秋眠型苜蓿刈割后再生速度快，產(chǎn)量高，但越冬率低；半秋眠型苜蓿介于二者之間[9]。國(guó)內(nèi)外針對(duì)不同秋眠類型的苜蓿也開展了大量研究，特別是翟曉朦等[10-13]針對(duì)CO2濃度升高對(duì)不同秋眠類型苜蓿生長(zhǎng)及生理的影響開展了一系列研究，但CO2濃度變化、秋眠類型及生長(zhǎng)期對(duì)苜蓿葉片解剖結(jié)構(gòu)影響的研究仍十分欠缺。為此，本研究選取具有代表性的3類秋眠級(jí)苜蓿(秋眠型、半秋眠型、極非秋眠型)作為試驗(yàn)材料，采用開頂式生長(zhǎng)室(open-top chambers,OTC)模擬大氣CO2濃度增加對(duì)苜蓿不同秋眠型、不同生長(zhǎng)期葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響及苜蓿對(duì)CO2濃度變化的響應(yīng)，為深入探討氣候變化對(duì)植物影響及植物的生態(tài)適應(yīng)性提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用苜蓿種子由北京林業(yè)大學(xué)提供，采用美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)秋眠性苜蓿對(duì)照品種：秋眠型Maverick(簡(jiǎn)稱FD1)、半秋眠型ABI 700(簡(jiǎn)稱FD6)和極非秋眠型UC 21465(簡(jiǎn)稱FD11)，代表3個(gè)不同的秋眠類型。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院順義試驗(yàn)站(38°39′27.97″ N，104°04′58.66″ E)進(jìn)行，該地屬暖溫帶半濕潤(rùn)氣候，年平均溫度11.2 ℃，年平均降水量為695.4 mm。試驗(yàn)在全透明的OTC中進(jìn)行，氣室是由高2.4 m、邊長(zhǎng)1.15 m的玻璃組成的八邊形框架結(jié)構(gòu)[12]，保證充足同質(zhì)的自然光照、土壤(V腐殖質(zhì)∶V黃黏土∶V蛭石=1∶1∶1)及水分條件(0-20 cm土層土壤含水量平均值在40%～45%)。試驗(yàn)?zāi)M當(dāng)前、21世紀(jì)中期和21世紀(jì)末的CO2濃度，設(shè)置3個(gè)CO2濃度梯度，探討不同秋眠型苜蓿在不同生長(zhǎng)期葉片解剖結(jié)構(gòu)的變化。試驗(yàn)組全天通入CO2氣體，通過傳感器控制OTC內(nèi)CO2濃度分別為(550±100) μmol·mol-1(T1)和(700±100) μmol·mol-1(T2)；對(duì)照組全天通入自然風(fēng)，CO2濃度為(350±50) μmol·mol-1(CK)。試驗(yàn)共設(shè)置12個(gè)OTC，分為3組；每個(gè)OTC放置8個(gè)花盆(口徑17 cm，高度12 cm)，花盆的大小、土壤量均保持一致，每花盆種植10株苜蓿。于5月5日播種開始試驗(yàn)，分別于分枝期(6月9日)、初花期(7月18日)、盛花期(8月19日)和成熟期(9月28日)取樣測(cè)定。

1.3 樣品制備與觀察

取相同葉位、成熟健康的新鮮葉片進(jìn)行清洗，用干紗布擦干，選取0.5 cm×1 cm的小片，采樣后立即置于FAA固定液中固定24 h以上。石蠟切片按常規(guī)方法以酒精脫水-石蠟包埋-切片(厚度8～10 μm)-番紅固綠對(duì)染-加拿大樹膠封片的步驟進(jìn)行[14]。對(duì)3個(gè)CO2處理(CK、T1、T2)、3種秋眠型(FD1、FD6、FD11)、5個(gè)生長(zhǎng)期(苗期、分枝期、初花期、盛花期、成熟期)各選10張切片，每一切片選取5個(gè)視野，共獲取3×3×5×50=2 250個(gè)視野數(shù)據(jù)。

在OLYMPUS光學(xué)顯微鏡下，分別測(cè)量表皮細(xì)胞厚度(epidemiscells thickness,ET)、柵欄組織厚度(palisade parenechyma thickness,PT)、海綿組織厚度(spongy parenchyma thickness,ST)和葉片總厚度(leaf thickness,LT)，并分別計(jì)算葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度(cell tense ratio,CTR,%)和葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度(spongy ratio,SR, %)：

CTR=PT/LT×100%;

SR=ST/LT×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

葉片解剖結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用Three-way ANOVA分析CO2濃度、秋眠型、生長(zhǎng)期及交互效應(yīng)對(duì)葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響。分別計(jì)算不同CO2濃度、不同秋眠類型、不同生長(zhǎng)期的解剖特征平均值，采用One-way ANOVA分別對(duì)CO2處理、秋眠類型和生長(zhǎng)期間的差異進(jìn)行分析，并利用LSD法進(jìn)行多重比較。采用One-way ANOVA分析同一秋眠型、同一生長(zhǎng)期植株在不同CO2濃度下的差異，并利用LSD法進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2濃度、秋眠型、生長(zhǎng)期對(duì)葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

苜蓿解剖結(jié)構(gòu)受CO2濃度、生長(zhǎng)期的影響較大，受秋眠類型影響較小(表1)。CO2處理對(duì)葉片厚度、表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、組織結(jié)構(gòu)緊密度、組織結(jié)構(gòu)疏松度有顯著影響(P<0.01)或極顯著影響(P<0.001)；秋眠類型僅對(duì)海綿組織厚度有顯著影響(P<0.05)；不同生長(zhǎng)期對(duì)所有葉片解剖結(jié)構(gòu)均有極顯著影響(P<0.001)。葉片解剖結(jié)構(gòu)不僅受單因素的影響，同時(shí)也受到多因子共同作用的影響。如CO2處理和生長(zhǎng)期的交互效應(yīng)，對(duì)葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度有極顯著影響(P<0.001)，對(duì)其他指標(biāo)影響不大；CO2處理與秋眠類型的交互效應(yīng)對(duì)葉片厚度(P<0.01)、海綿組織厚度有顯著影響(P<0.05)，對(duì)其他指標(biāo)影響不大；生長(zhǎng)期與秋眠類型的交互效應(yīng)和三者的交互效應(yīng)對(duì)葉片厚度、表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、組織結(jié)構(gòu)緊密度有顯著(P<0.01)或極顯著影響(P<0.001)，對(duì)SR影響不大。

表1 CO2濃度、秋眠型、生長(zhǎng)期對(duì)葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effect of CO2 concentration, fall dormancy and growth stage on leaf anatomical structure

同列不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。FD1、FD6、FD11分別表示秋眠型Maverick、半秋眠型ABI 700和極非秋眠型UC 21465，***,P<0.001, **,P<0.01, *,P<0.05。

Different lowercase letters indicate significant difference among treatments based on One-way ANOVA. FFD1, FD6, FD11indicate Maverick，ABI 700 and UC 21465, respectively. ***,P<0.001, **,P<0.01, *,P<0.05.

2.2 CO2濃度對(duì)葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

隨CO2濃度升高苜蓿葉片平均厚度顯著增厚(P<0.05)，T1、T2較CK分別增加了14.9%、22.1%，且三者間差異均顯著(P<0.05，表1，圖1)。不同秋眠型葉片平均厚度差異不顯著(P>0.05，表1)。葉片平均厚度隨生長(zhǎng)期的延遲顯著增厚(P<0.05)，分枝期、初花期、盛花期、成熟期較苗期分別增加了17.4%、31.5%、53.6%、67.1%，且不同生長(zhǎng)期之間差異顯著(P<0.05，表1，圖1)。

圖1 不同濃度CO2處理對(duì)葉片厚度和表皮厚度的影響Fig. 1 Effect of different CO2 concentrations on leaf and epidermal thickness

不同小寫字母代表同一秋眠型、同一生長(zhǎng)期植株在不同CO2濃度處理之間差異顯著(P<0.05)。下同。

Different lowercase letters indicate significant difference among different CO2concentration with the same fall dormancy and growth period; similarly for the following figures.

隨CO2濃度升高苜蓿表皮平均厚度顯著增厚(P<0.05)，T1、T2較CK分別增加了4.0%、8.6%，且三者之間差異均顯著(P<0.05，表1，圖1)。不同秋眠型表皮平均厚度差異不顯著(P>0.05，表1)。表皮平均厚度隨生長(zhǎng)期的變化顯著增厚(P<0.05)，分枝期、初花期、盛花期、成熟期較苗期分別增加了8.3%、14.3%、21.3%、26.3%，且不同生長(zhǎng)期之間差異顯著(P<0.05，表1，圖1)。

隨CO2濃度升高苜蓿柵欄組織平均厚度顯著增厚(P<0.05)，T1、T2較CK分別增加了17.6%、25.4%，且三者之間差異均顯著(P<0.05，表1，圖2)。不同秋眠型柵欄組織平均厚度差異不顯著(P>0.05，表1)。柵欄組織平均厚度隨生長(zhǎng)期的變化顯著增厚(P<0.05)，分枝期、初花期、盛花期、成熟期較苗期分別增加了20.2%、40.1%、64.5%、80.1%，且不同生長(zhǎng)期之間差異顯著(P<0.05，表1，圖2)。

隨CO2濃度升高苜蓿海綿組織平均厚度顯著增厚(P<0.05)，T1、T2較CK分別增加了17.8%、25.5%，且三者之間差異均顯著(P<0.05，表1，圖2)。不同秋眠型海綿組織平均厚度差異不顯著(P>0.05，表1)。海綿組織平均厚度隨生長(zhǎng)期的變化顯著增厚(P<0.05)，分枝期、初花期、盛花期、成熟期較苗期分別增加了19.7%、31.8%、60.4%、76.6%，且不同生長(zhǎng)期之間差異顯著(P<0.05，表1，圖2)。

隨CO2濃度升高組織結(jié)構(gòu)緊密度平均值顯著增大(P<0.05)，T1、T2較CK分別增加了1.9%、2.6%，且T1、T2間差異不顯著，與CK差異顯著(P<0.05，表1，圖3)。不同秋眠型苜蓿組織結(jié)構(gòu)緊密度平均值差異不顯著(P>0.05，表1)。組織結(jié)構(gòu)緊密度平均值隨生長(zhǎng)期的變化差異顯著(P<0.05)，分枝期、初花期、盛花期、成熟期較苗期分別增加了2.1%、6.5%、7.1%、7.7%；苗期組織結(jié)構(gòu)緊密度最小，與其他4個(gè)生長(zhǎng)期差異顯著；成熟期組織結(jié)構(gòu)緊密度最大，僅與苗期、分枝期差異顯著(P<0.05，表1，圖3)。

圖2 不同濃度CO2處理對(duì)柵欄和海綿組織厚度的影響Fig. 2 Effect of different CO2 concentrations on palisade and spongy tissue thickness

隨CO2濃度升高組織結(jié)構(gòu)疏松度平均值顯著增大(P<0.05)，T1、T2較CK分別增加了2.23%、2.26%，且T1、T2間差異不顯著，與CK差異顯著(P<0.05，表1，圖3)。不同秋眠型組織結(jié)構(gòu)疏松度平均值差異不顯著(P>0.05，表1)。組織結(jié)構(gòu)疏松度平均值隨生長(zhǎng)期的變化顯著(P<0.05)，分枝期、初花期、盛花期、成熟期較苗期分別增加了1.6%、0.3%、4.2%、5.5%；初花期組織結(jié)構(gòu)疏松度均值最小，成熟期組織結(jié)構(gòu)疏松度最大(P<0.05，表1，圖3)。

圖3 不同濃度CO2處理對(duì)CTR和SR的影響Fig. 3 Effect of different CO2 concentrations on CTR and SR

3 討論與結(jié)論

植物葉片解剖結(jié)構(gòu)是研究植物對(duì)不同生境的結(jié)構(gòu)與功能適應(yīng)性的重要材料，特別是研究植物對(duì)大氣CO2變化的響應(yīng)具有重要意義。CO2是植物進(jìn)行光合作用和初級(jí)代謝的基本物質(zhì)，CO2加富對(duì)植物葉片解剖結(jié)構(gòu)有明顯影響，大量研究表明CO2濃度升高顯著增加了C3植物葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度[14]，該結(jié)論在本研究得到了進(jìn)一步證實(shí)，苜蓿葉片總厚度和各組織厚度均有明顯加厚。柵欄組織應(yīng)對(duì)CO2加富的方式可分為兩種：CO2濃度升高促進(jìn)植物葉片細(xì)胞的分裂，使柵欄組織層數(shù)增加[15-16]；CO2濃度升高使柵欄組織、海綿組織細(xì)胞的體積變大，葉片厚度增加[17]。柵欄組織層數(shù)及厚度是衡量植物光合作用強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[18-19]，因?yàn)闁艡诮M織含有大量的葉綠體，其層數(shù)及厚度增加能提高植物葉片對(duì)光合和環(huán)境CO2的吸收能力。海綿組織通常由一些排列較疏松、不規(guī)則形細(xì)胞組成，胞間隙發(fā)達(dá)，主要進(jìn)行氣體交換[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，高CO2濃度下苜蓿的柵欄組織層數(shù)未發(fā)生變化，但明顯增厚，海綿組織增厚，這是苜蓿葉片應(yīng)對(duì)CO2濃度升高的適應(yīng)性策略[21]，因?yàn)闁艡诮M織和海綿組織加厚，增加了葉綠體含量和氣體交換速率，進(jìn)而提高光合作用速率和適合度，該結(jié)論也在翟曉朦等[11]的研究中得到了驗(yàn)證。

秋眠性是苜蓿的重要特性，由于秋季光照時(shí)長(zhǎng)變短和氣溫下降，其莖枝出現(xiàn)匍匐生長(zhǎng)、生長(zhǎng)減緩甚至停止。已有研究發(fā)現(xiàn),光周期[20,22-24]、溫度[25-27]等對(duì)不同秋眠類型苜蓿有顯著影響，但本研究不同CO2濃度對(duì)苜蓿葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響不大?？赡苁且?yàn)槿~片是對(duì)CO2變化最敏感的器官[28]，能夠準(zhǔn)確反映出CO2對(duì)其產(chǎn)生的直接影響；而秋眠性受光照時(shí)長(zhǎng)、氣溫的影響較大，受CO2的影響相對(duì)較小。

不同功能型植物在同一生長(zhǎng)期，葉片解剖結(jié)構(gòu)可能完全不同；同一植物的不同發(fā)育階段，葉片解剖結(jié)構(gòu)也會(huì)有所差異[29]。如銀杏(Ginkgobiloba)在展葉期無柵欄組織和海綿組織的分化；展葉后葉肉分化為柵欄組織1～2層，細(xì)胞呈長(zhǎng)橢球形，海綿組織發(fā)達(dá)，細(xì)胞呈橫向排列的橢球形；衰老期部分海綿組織細(xì)胞變小，并縱向排列，通氣系統(tǒng)發(fā)達(dá)[30]。沙芥(Pugioniumcornutum)幼苗期柵欄組織細(xì)胞間隙大，海綿組織細(xì)胞排列緊密，幾乎沒有細(xì)胞間隙；旺盛生長(zhǎng)期海綿組織細(xì)胞形狀不規(guī)則，具細(xì)胞間隙[31]。連香樹(Cercidiphyllumjaponicum)幼葉發(fā)育早期葉肉組織無明顯分化，成熟葉片的柵欄組織細(xì)胞在層數(shù)和細(xì)胞形態(tài)上與分化初期差異不大，但細(xì)胞壁較幼期厚，細(xì)胞經(jīng)向有一定伸長(zhǎng)[29]。多年生黑麥草(Loliumperenne)在生長(zhǎng)旺盛季，葉肉細(xì)胞的生長(zhǎng)與CO2濃度升高呈正相關(guān)關(guān)系，而在生長(zhǎng)緩慢季，葉片細(xì)胞的生長(zhǎng)與CO2濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[32]。本研究中，苜蓿隨著時(shí)間變化，其葉片厚度、柵欄組織、海綿組織均有一定程度加厚，這與其在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段對(duì)生活環(huán)境的適應(yīng)密切關(guān)聯(lián)。因?yàn)椴煌l(fā)育階段的細(xì)胞對(duì)CO2的傳遞阻力不同[18]，而葉肉組織通過細(xì)胞對(duì)CO2的傳遞阻力來影響葉片的光合作用[33]，苜蓿葉片各解剖結(jié)構(gòu)的協(xié)同變化提高了葉片本身的光合能力[10]，進(jìn)而提高整個(gè)植物的生物量[11]。

綜上所述，葉片解剖結(jié)構(gòu)受CO2濃度變化、生長(zhǎng)期的影響較大，受秋眠類型影響較小；且受三因子交互效應(yīng)影響顯著。解剖結(jié)構(gòu)厚度隨CO2濃度升高顯著增加(P<0.01)，這有利于增加葉綠體含量和氣體交換速率，進(jìn)而提高光合作用速率和牧草產(chǎn)量，是苜蓿應(yīng)對(duì)CO2濃度增加的適應(yīng)性反應(yīng)；葉片厚度、表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度隨生長(zhǎng)期變化顯著增加(P<0.01)，這可能是苜蓿葉片解剖結(jié)構(gòu)協(xié)同變化的結(jié)果；但葉片解剖結(jié)構(gòu)在不同秋眠類型間差異不大(P>0.05)，是因?yàn)榍锩咝允芄庹諘r(shí)長(zhǎng)、氣溫的影響較大，受CO2的影響相對(duì)較小。本研究為預(yù)測(cè)CO2濃度變化對(duì)植物的影響提供了重要的數(shù)據(jù)支撐，但在自然條件下，伴隨CO2濃度升高，土壤肥力、水分及土壤微生物等均會(huì)發(fā)生變化，研究解剖結(jié)構(gòu)受多個(gè)因子的綜合影響，對(duì)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)未來氣候變化對(duì)植物的影響及植物的適應(yīng)策略具有重要意義，其中涉及的相互作用機(jī)理尚待生理和分子方面的進(jìn)一步研究。