青藏高原中華羊茅種質資源遺傳多樣性的EST-SSR分析

許利英，周青平，陳仕勇，陳有軍，李亞萍，田莉華

(1.西南民族大學生命與科學技術學院，四川 成都 610041； 2.西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041)

中華羊茅(Festucasinensis)是禾本科羊茅屬多年生草本植物，是中國西北、華北、東北和青藏高原等地常見的野生牧草，常生于海拔2 600～4 800 m的高山草甸、山坡草地、灌叢、林下等地。中華羊茅作為高寒牧區(qū)草地生產建設的優(yōu)良牧草，具有營養(yǎng)價值高、適口性好、再生性和抗逆性強等特點。莖稈柔軟，馬、牛、羊都比較喜食，其中在夏、秋、春三季是各類牲畜的主要牧草，易增膘長肉。同時，中華羊茅適應性廣，耐寒性和刈割能力強，是高寒牧區(qū)草地建設、退牧還草和生態(tài)治理工程中最適宜的優(yōu)良牧草品種之一,也是我國青藏高原地區(qū)代表性的優(yōu)良牧草之一[1-3]。因此，開展中華羊茅種質資源及其適應性的研究對我國高寒牧區(qū)畜牧業(yè)的發(fā)展以及生態(tài)恢復建設具有重要意義?厱

目前對中華羊茅的研究多集中在栽培草地建設、抗逆性及內生真菌等方面[4-7]，但關于其種質資源遺傳多樣性方面的研究還未見報道。王康英[4]發(fā)現(xiàn)，在3種鈉鹽(NaCl、NaHCO3、Na2CO3)脅迫下中華羊茅種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均隨著鹽濃度的升高而降低。汪建軍等[5]對溫度和PEG處理對中華羊茅種子萌發(fā)的影響進行系統(tǒng)的分析，表明低濃度(-0.2 MPa)的PEG溶液對中華羊茅種子活力具有促進作用，高濃度(-0.8 MPa)的PEG溶液則對其種子活力有抑制作用。

目前分子標記技術已被廣泛用于羊茅屬物種的遺傳育種研究，特別是在高羊茅等代表性物種上的相關研究較多[8-11]。其中SSR標記應用最為廣泛，其具有重復性好，結果可靠性高，操作簡單；多態(tài)性豐富且標記數(shù)量多等特點。在植物遺傳育種研究中作為一種主要的分子標記技術已廣泛應用于遺傳圖譜的構建、遺傳多樣性分析和系統(tǒng)學研究[12]。本研究采用EST-SSR分子標記技術對來自青藏高原地區(qū)的24個中華羊茅種質資源進行遺傳多樣性的評價分析，旨在為中華羊茅野生種質的鑒定、保護及利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

24份中華羊茅樣品分別采集自四川、西藏和青海等青藏高原地區(qū)(表1)，其中23份為野生種質資源，1份為登記品種。供試材料種子于2016年12月播種于花盆中，放置在人工氣候培養(yǎng)箱內，待其生長到3～4片葉時取樣。

1.2 DNA提取

每份中華羊茅材料選取10～15個單株的葉片混合，采用植物基因組DNA提取試劑盒(DP305，由天根生化科技有限公司提供)提取樣品的DNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(NANODROP LITE)檢測DNA樣品的純度和濃度。

1.3 引物篩選

選用65對羊茅屬高羊茅的基因組SSR分子標記的引物進行擴增分析[13]。選擇形態(tài)差異大、海拔高差大的4份中華羊茅材料，提取DNA，利用65對高羊茅SSR 引物進行PCR擴增。選用多態(tài)性好、條帶清晰的引物，對全部24份中華羊茅材料進行分析。

1.4 PCR擴增

SSR 反應體系(20 μL)：模板DNA 2 μL (20 ng)，SSR引物 2 μL，2×Es Taq MasterMix(Dye) 10 μL，加ddH2O 6 μL。擴增反應在JY966 Thermal Cycler型PCR循環(huán)儀上進行。反應程序為：94 ℃預變性 5 min;94 ℃變性30 s,64 ℃退火 30 s,72 ℃ 延伸50 s,25個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min,4 ℃保存。擴增產物在6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離110 min，電泳結束后進行銀染并用數(shù)碼相機照相保存。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)PCR 擴增產物的電泳結果，在相同遷移位置上，將穩(wěn)定、清晰的條帶記為1，無帶或不易分辨的弱帶記為0，獲得原始數(shù)據(jù)矩陣。統(tǒng)計其每對引物總擴增條帶和多態(tài)位點、多態(tài)位點百分比(percent of polymorphism bands,PPB)和多態(tài)性信息含量(polymorphic information content,PIC)。在 NTSYS 軟件計算供試材料間的Dice遺傳相似系數(shù)，并基于Dice遺傳相似系數(shù)進行UPGMA聚類分析和主成分分析(principal component analysis,PCA)[14]。采用GenAlEx 6.5計算供試材料地理距離、海拔與遺傳距離的Mantel相關性分析[15]。采用POPGENE 1.31計算不同海拔類群的Nei’s基因多樣性和香農指數(shù)(Shannon-Wiener index)[16]。

表1 中華羊茅材料信息Table 1 Data concerning Festuca sinensis

續(xù)表1

序號No.編號Material No.來源地Origin海拔Elevation/m經(jīng)度Longitude(E)緯度 Latitude(N)20I-2-23-7青海格爾木市唐古拉山口Tanggula Mountains, Golmud City, Qinghai5 19791°55'336″32°54'246″2110-66青海曲瑪萊縣曲瑪河鄉(xiāng)Qumahe Township, Qumaleb County, Qinghai4 61793°57'485″35°32'876″2210-52青海曲瑪萊縣曲瑪河鄉(xiāng)Qumahe Township, Qumaleb County, Qinghai4 61793°57'485″35°32'876″2310-121青海德令哈縣柯魯柯鎮(zhèn)Kelukezhen Town, Delingha City, Qinghai2 91297°99'044″37°17'138″24I-2-23-2西藏那曲地區(qū)安多縣Amdo County, Nagqu Prefecture, Tibet5 06791°50'995″31°37'138″

2 結果與分析

2.1 SSR多樣性分析

從65對高羊茅SSR引物中共篩選出17對條帶型清晰、多態(tài)性好的引物。利用這些引物，對24份中華羊茅的DNA進行擴增(表2)。本研究中供試材料的電泳條帶均在100～500 bp(圖 1)。同時不同引物擴增的位點數(shù)不同，同一引物對24份資源擴增的條帶類型和位點數(shù)也不一樣。17對引物在供試的24份資源中共檢測到102個位點，其中多態(tài)性位點95個，多態(tài)性比率為93.14%,平均每對引物的多態(tài)性位點5.59個。每條引物擴增的位點數(shù)4～8個，平均每條引物檢測到6個位點，多態(tài)性信息含量指數(shù)PIC值變化為0.240～0.470，平均值為0.381。這也表明篩選的高羊茅SSR標記在中華羊茅中具有較好的通用性和高多態(tài)性。

2.2 遺傳關系分析

本研究中24份中華羊茅種質資源間的遺傳相似系數(shù)在0.188～0.675，平均值為0.486。其中I-14-1-1與I-2-23-7之間的親緣關系最遠，遺傳相似系數(shù)為0.188；09-124(青海平安)與09-141(青海平安)的親緣關系最近，遺傳相似系數(shù)為0.675，這都表明了供試的中華羊茅種質間具有豐富的遺傳變異。

2.3 聚類分析及主成分分析

根據(jù)各個資源間的Dice遺傳系數(shù)對24份中華羊茅種質資源進行UPGMA聚類，結果表明在遺傳距離0.52處可將其分為八大類(圖2)。第Ⅰ類由來自青海的1號(09-099)和來自西藏的9號(09-261)資源2份材料組成。第Ⅱ類包括了5個材料，均來自青海，其中來自青海格爾木的3號(09-141)和來自青海平安的4號(09-124)材料具有非常近的親緣關系。第Ⅲ類由6份材料組成，包括來自青海的5號、7號、11號、12號和來自西藏的6號，以及來自四川的8號材料組成。第Ⅳ類包括了6份材料，其中3份來自青海，2份來自西藏，四川1份。第Ⅴ類包括2份資源，分別來自青海的23號(10-121)和西藏的24號(I-2-23-2)資源。第Ⅵ類由1份材料組成，是來自青海的10號(10-116)。第Ⅶ類由來自四川的16號(I-14-1-1)材料構成。第VIII類由一份材料20號(I-2-23-7)來自青海的構成。這兩份材料與其他材料間表現(xiàn)出了較遠的親緣關系，在遺傳上表現(xiàn)了一定的特異性。

基于供試材料間遺傳相似系數(shù)進行PCA分析,結果表明第1主成分的變異解釋比率為62.01%,第2主成分變異解釋比率為3.40%，第3主成分變異解釋比率為3.24%,3個主成分累計解釋的變異比率為68.65%,大體上能夠反映中華羊茅各個資源間親緣關系的遠近，與聚類的結果基本保持一致。

2.4 地理分化分析

供試24份材料的遺傳距離與地理距離的mantel檢驗結果表明二者之間相關性較低且不顯著(r=0.062，P=0.139),這與聚類分析的結果相一致。海拔與種質間的遺傳距離之間的相關性也較低(r=0.05，P=0.492)。根據(jù)本研究中供試材料的海拔分布，將供試材料分為3個不同的海拔類群，即低海拔組(2 500-3 000 m)、中海拔組(3 000-3 600 m)和高海拔組(4 000-5 000 m)。不同海拔類群的遺傳變異分析顯示(表3)，分布于中度海拔(3 000-3 500 m)的中華羊茅種質具有最高的Nei’s基因多樣性(0.304 3)和香農多樣性指數(shù)為0.462 2，遺傳變異較高；高海拔地區(qū)(4 000-5 000 m)的種質遺傳變異較低，其Nei’s基因多樣性0.249 7,香農多樣性指數(shù)為0.395 6;而低海拔類群種質(2 500-3 000 m)具有適中的遺傳變異，其Nei’s基因多樣性為0.284 9,香農多樣性指數(shù)為0.432 7。

表2 17對引物序列和擴增結果Table 2 Primer sequences and amplification results

圖1 NFA017引物電泳擴增圖Fig. 1 Electrophoresis amplification by primer NFA017

海拔范圍Altitude range/m樣本數(shù)NNei’s基因多樣性 Nei’s gene diversity香農指數(shù)Shannon-Wiener index2 500-3 00080.284 90.432 73 000-3 60070.304 30.462 24 000-5 00090.249 70.395 6

3 討論

由于不受環(huán)境影響，不受限于植物的發(fā)育階段，分子標記已成為遺傳多樣性評價的強有力的主流研究手段[17-18]，廣泛應用于植物遺傳育種的各個方面[19]。在羊茅屬資源中，SSR也已經(jīng)用于遺傳評價、圖譜構建、關聯(lián)分析等工作[18]。Romina等[10]用15條引物檢測161份來自不同國家的高羊茅(Festucaarundinacea),共檢測到214個多態(tài)性基因，平均每條引物檢測到5～24個，遺傳距離變幅范圍為0.627～0.840，體現(xiàn)了較高的遺傳多樣性。Saha等[13]在高羊茅中開發(fā)了152對SSR引物，其中92%的引物能夠擴增出條帶。同時，這些標記在不同的物種中表現(xiàn)出了不同的多態(tài)性比率。在羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)等異花授粉植物中檢測到66%的多態(tài)性標記，而在水稻(Oryzasativa)和小麥(Triticumaestivum)中僅有43%和38%的多態(tài)性標記。本研究選用了其中的65對引物在中華羊茅中進行擴增，最后篩選出了17對效果較好的標記。這也表明高羊茅引物在中華羊茅中具有較好的通用性和多態(tài)性，是其資源遺傳評價等有效的SSR標記來源。

基于遺傳相似系數(shù)的聚類分析等結果表明，供試材料的聚類并沒有與其地理來源表現(xiàn)出較高的相關性，其中西藏、四川的材料與青海的材料間聚類存在交叉。這可能與中華羊茅異花授粉的繁育方式相關，不同地區(qū)種質間存在廣泛的基因流，如來自青海平安的7份材料除了3號(09-141)資源與4號(09-124)資源聚在一類，其他5份資源分別與不同地理來源的資源聚在一類，這與鴨茅(Dactylisglomerata)和多花黑麥草(L.multiflorum)等異花授粉牧草的種質資源評價特點表現(xiàn)出了一定的相似性[20-23]。此外，其中16號材料I-14-1-1和20號材料I-2-23-7在形態(tài)學和生理抗性上也表現(xiàn)出了特異性，與其遺傳特異性相吻合，如16號葉片較為纖細，對干旱、復水等處理非常敏感，而20號材料則葉片較寬，莖較粗壯有一定的耐旱性。

通過遺傳距離與地理距離的分析發(fā)現(xiàn)兩者沒有明顯的相關性，但發(fā)現(xiàn)在海拔梯度呈現(xiàn)一定的遺傳分化。嚴學兵等[23]發(fā)現(xiàn)海拔高度對披堿草(Elymusdahuricus)的遺傳進化和選擇起著巨大的作用；Chen等[24]對于青藏高原垂穗披堿草(E.nutans)遺傳分化的研究也揭示了中度海拔的材料具有較高的遺傳變異，與本研究結果相似。本研究中高海拔種質具有相對較低的遺傳變異，這與其較高海拔具有相對較惡劣的生態(tài)環(huán)境有關，也是其資源保護的重點；而低海拔的遺傳變異較低與人為的過度干擾等因素有關，中等海拔具有相對較高的遺傳多樣性，這些結果為中華羊茅種質資源的保護和利用提供了重要的參考。

4 結論

本研究中采用SSR標記對來自青藏高原地區(qū)的24 份中華羊茅種質資源的遺傳變異及親緣關系進行了分析，選用的高羊茅SSR標記在中華羊茅中表現(xiàn)出了較好的通用性，結果揭示了供試材料間具有豐富的遺傳變異，明確了不同地理來源的材料間的遺傳親緣關系。其中I-14-1-1與其他野生種質表現(xiàn)出了較遠的親緣關系；中等海拔3 000-3 600 m類群的材料具有較高的遺傳變異，研究結果為中華羊茅的資源保護及利用提供了重要參考。