β-七葉皂苷鈉對高壓電損傷后早期大鼠的組織抗?jié)B作用

溫豐平,吳 昊，周文來

隨著電器應用數量的不斷上升及電器工業(yè)的發(fā)展，電損傷造成機體嚴重損傷的病例日漸增多。北美每年有約20 000例電損傷急診患者[1]，電損傷是世界范圍內創(chuàng)傷的重要原因[2],有報道稱電損傷占燒傷住院患者的10%[3]。電損傷的主要特點是血管的損傷，受損區(qū)域組織嚴重水腫，組織間壓力增高，加劇炎癥反應，進而引起局部皮膚及軟組織進行性壞死[4-6]。因此降低血管通透性、減輕組織腫脹及炎癥反應對電損傷的臨床治療及并發(fā)癥預防有重要意義。已有研究[7-9]證實β-七葉皂苷鈉具有抗?jié)B、抗炎、改善微循環(huán)等作用。本文對高壓電損傷早期β-七葉皂苷鈉的抗?jié)B作用作初步探討。

材料與方法

1 儀器與試劑

電擊設備自制，包括調壓器、時間繼電器、電流電壓計及銅制電極板等；721-100型分光光度計(上海第三分析儀器廠)；恒溫干燥箱(上海醫(yī)療器械七廠)；電熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械七廠)；注射用β-七葉皂苷鈉(武漢愛民制藥有限公司，批號100908A)；地塞米松磷酸鈉注射液(湖北天藥藥業(yè)，批號20100916)；伊文思藍(EB,美國Biosharp公司)；二甲酰胺(美國Biosharp公司)。

2 動物模型制作及實驗分組

電損傷動物模型制作參照本課題組以前報道[10]。自制電擊設備由下列裝置組成：調壓器(0～380V可調，額定功率3 000W)、電流保護裝置、時間繼電器(精確到10ms)、控制開關、升壓變壓器(可達500～2 000V，最大功率3 500W)、電流、電壓計、銅制電極板2塊(大電極板8mm×8mm，小電極板3mm×3mm)。將兩電極間電壓設定為1 500V， 電擊時間0.2s。實驗動物大鼠以3%戊巴比妥按10mg/kg腹腔注射麻醉，剃除臀部及右后肢毛，仰臥位固定于實驗臺上，置小電極板于右小腿踝上0.5cm處腹側腓腸肌處皮膚上，大電極板于同側臀肌上，對大鼠右側后肢進行電擊實驗。電擊后創(chuàng)面不予特殊處理。

實驗動物為雄性SD大鼠100只(武漢大學動物實驗中心)，體質量230～280g，月齡2個月，隨機分為β-七葉皂苷鈉組(50只)和對照組(50只)，制成高壓電燒傷模型。β-七葉皂苷鈉組于電損傷后經尾靜脈注射β-七葉皂苷鈉2.5mg/kg，對照組同時給予等體積的生理鹽水。各組分別按電損傷后1、6、24、48、72h分為5小組，每小組10只。各動物于開胸灌洗時處死。

3 血管通透性測定

參照改良伊文思藍滲出法[11]，處死前0.5h按前述方法麻醉大鼠，從尾靜脈注射1%伊文思藍2mL/kg，隨后開胸經左室灌注250mL 0.9%氯化鈉溶液，沖洗干凈全身循環(huán)血液及體內的伊文思藍。沿創(chuàng)面邊緣切取創(chuàng)周含肌肉組織0.5cm×0.5cm稱重后浸泡于含3mL二甲酰胺液體的EP管中，50℃恒溫水浴箱中孵育24h。以3 000rpm離心5min，取離心后的萃取液，以分光光度儀測定光密度值。比照標準曲線得出伊文思藍含量,單位創(chuàng)周組織伊文思藍含量計算方法如下：伊文思藍(μg/g)=測定值(μg)/組織重量(g)。

4 組織含水量測定

實驗動物創(chuàng)緣切取創(chuàng)周組織1.5cm×1.5cm，稱重后置烤箱內，以90℃連續(xù)烘干72h,用電子天平稱取標本干重,將標本放入烤箱再烤12～24h,重復上述過程稱第二次干重。如此反復,直至兩次標本干重相差<0.2mg,即恒重為止。每mg單位組織含水量(%)=(濕重-干重) /濕重。

5 組織學觀察

同時切取創(chuàng)周含微動脈的組織行日立H-600型透射電鏡觀察并照相。

6 統(tǒng)計學分析

結 果

1 大體觀察

注射伊文思藍過程中，生理鹽水對照組大鼠全身器官組織迅速藍染，注射完畢后可見肌肉、皮膚和鞏膜均呈紫藍色，尤以后肢電燒傷創(chuàng)周明顯(圖1)，β-七葉皂苷鈉組藍染程度較輕(圖2)。兩組經生理鹽水灌注后可見全身組織藍染變淡乃至藍色消失。

圖1 對照組大鼠創(chuàng)周藍染明顯(傷后1h)圖2 β-七葉皂苷鈉組大鼠創(chuàng)周藍染較輕(傷后1h)

2 β-七葉皂苷鈉對創(chuàng)周組織血管通透性的影響

β-七葉皂苷鈉組1、6、24、48h和72h 5個時相點EB濃度分別為(293.15±64.45)μg/g、(239.37±41.47)μg/g、(259.49±33.74)μg/g、(243.62±32.78)μg/g、(226.25±29.69)μg/g,對照組相應EB濃度為(402.10±43.22)μg/g、(282.45±28.05)μg/g、(322.65±29.01)μg/g、(300.66±41.15)μg/g、(273.01±39.43)μg/g，β-七葉皂苷鈉組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。通過創(chuàng)周組織EB含量測定得出對照組創(chuàng)周組織的血管通透性顯著高于β-七葉皂苷鈉組，尤以損傷后1h最明顯，隨時間推移通透性均有緩慢恢復的趨勢。見圖3。

與對照組比較：*P<0.01,**P<0.05

3 β-七葉皂苷鈉對組織含水量的影響

β-七葉皂苷鈉組1、6、24、48h和72h 5個時相點組織含水量分別為(73.08±2.04)%、(80.47±2.23)%、(78.36±1.97)%、(77.22±1.15)%、(75.16±3.00)%，對照組相應時相點組織含水量分別為(76.30±2.6)%、(84.68±1.71)%、(82.18±2.09)%、(80.57±2.27)%、(79.15±2.22)%，與對照組相比，各時相點差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。電損傷后創(chuàng)周組織含水量較低，后緩慢升高，傷后6h達高峰呈高度水腫狀態(tài)，對照組大體標本上創(chuàng)周可見明顯滲出。傷后24h組織含水量緩慢下降。見圖4。

與對照組比較：*P<0.01,**P<0.05

4 透射電鏡觀察β-七葉皂苷鈉對組織滲出的影響

電鏡顯示血管內皮受損，部分缺如，管壁破壞不規(guī)則，線粒體腫脹嵴變短斷裂或消失，血液淤滯管腔，部分可見附壁微血栓形成。其中，對照組較β-七葉皂苷鈉組表現重。見圖5。

圖5 大鼠創(chuàng)周電鏡觀察。a.正常大鼠內皮結構(×8 000)；b.β-七葉皂苷鈉組傷后1h,內皮腫脹，管壁結構比較完整(×10 000)；c.對照組傷后1h,管壁結構斷裂不規(guī)則，內皮細胞腫脹，胞漿滲出至管壁外，血管通透性增強(×20 000)；d.對照組傷后1h，內皮腫脹，胞漿水腫，連接增寬，管壁斷裂多層狀不規(guī)則，滲出增多(×15 000)；e.β-七葉皂苷鈉組傷后6h,內皮細胞腫脹，間隙增寬，結構尚規(guī)則，管壁部分斷裂不連續(xù)(×8 000)；f.β-七葉皂苷鈉組傷后6h，內皮細胞腫脹,管壁結構尚完整，周細胞凋亡(×10 000)；g.對照組傷后6h，內皮細胞及周細胞凋亡溶解，易染色質顏色加深，凝聚成塊，向核膜邊緣聚集，管壁結構破壞(×10 000)；h.對照組傷后6h，內皮細胞凋亡，管壁增厚，基質增生，通透性增加(×20 000)

討 論

電損傷的病理生理改變非常復雜,具有極高的致殘率和致死率，遺留嚴重的功能障礙[12]。高壓電損傷是電熱和電流共同作用的結果[13]，一定程度上會導致嚴重的局部組織和全身性損傷，不僅易造成全層皮膚的燒傷，還往往深達肌腱、骨骼、神經及血管等深部重要結構。由于血管電阻低，通過血管的電流較其他組織多，造成血管內皮細胞的變性、水腫及壞死，損傷血管壁，進而引起血管栓塞，造成供血區(qū)域組織的炎癥、壞死。受損區(qū)域嚴重組織水腫，組織間壓力增高，可壓迫血管進一步加劇受傷組織的血運障礙，大量處于間生態(tài)的組織隨時間的推移而進行性壞死。

血管通透性增高是指在急慢性炎癥組織中微血管對大分子物質特別是血漿蛋白通透性的增高[14]。血管屏障功能的維持有賴于內皮細胞之間連接的完整性及凝血和補體系統(tǒng)等體液系統(tǒng)的平衡。內皮細胞收縮性的改變被認為是不同信號和機制導致通透性變化的最后共同通路[15]。β-七葉皂苷鈉能增強細胞鈣通透性，增強血管平滑肌收縮力，保持血管張力從而減少滲出，穩(wěn)定和保護血管內皮[16]。β-七葉皂苷鈉已經被證實可以有效阻止炎癥中腫脹的形成，尤其是在炎癥急性滲出期，由于炎癥初期是以血管通透性改變?yōu)橹鳎师?七葉皂苷鈉可以通過降低毛細血管通透性來緩解組織腫脹和滲出。

Loddick等[17]進一步證實了β-七葉皂苷鈉的抗?jié)B作用，在制成的大鼠漿液性腹膜炎模型和大鼠漿液性胸膜炎模型中應用β-七葉皂苷鈉減少了滲出液量和蛋白滲出至腹腔。β-七葉皂苷鈉抗?jié)B和“密封毛細血管壁”的主要機制為：(1)腎上腺皮質激素作用：β-七葉皂苷鈉通過刺激腎上腺皮質激素的釋放來發(fā)揮抗?jié)B作用[18]；(2)與前列腺素有關：β-七葉皂苷鈉能增加抗?jié)B因子前列腺素F2α(PGF2α)合成，拮抗PGE1的增大血管內皮細胞間隙效應[19]，PGF2α還具有強烈的膜穩(wěn)定作用，可加快靜脈血流，促進淋巴回流，改善血液循環(huán)；(3)降低組織因子組胺和5-羥色胺[20]；(4)清除氧自由基，加強細胞對鈣的通透性，增加靜脈張力，穩(wěn)定保護血管內皮細胞[21-22]。

本實驗結果表明，大鼠高壓電損傷后早期血管通透性和組織含水量均升高，應用β-七葉皂苷鈉的大鼠創(chuàng)面損傷情況均較對照組減輕，血管通透性升高程度和組織含水量明顯低于對照組大鼠，傷后肢體腫脹程度減輕。魏民[23]在七葉皂苷鈉對四肢骨折患者消腫研究中也發(fā)現，骨折肢體腫脹(++)消腫至正常平均只需4.6d，腫脹從(+++)消腫至正常平均只需6.2d，療程大大縮短，證實了七葉皂苷鈉對創(chuàng)傷性肢體腫脹有較快的消腫作用。

綜上所述，β-七葉皂苷鈉在高壓電損傷早期具有明顯的抗?jié)B作用。臨床上包括電損傷在內的各種創(chuàng)傷后肢體均有不同程度腫脹滲出，嚴重時可形成骨筋膜室綜合征影響患肢血供甚至發(fā)生壞死及低血流量性休克，因此臨床上應用療效確切的消除電損傷水腫的藥物非常必要。β-七葉皂苷鈉已被廣泛應用于各種原因導致的腦水腫、創(chuàng)傷、骨折、燒傷、手術后腫脹及慢性靜脈功能障礙相關性疾病[24]。β-七葉皂苷鈉的藥理作用顯示出對電損傷良好的治療前景，將大大改善高壓電損傷組織進行性壞死的狀況，提高電損傷治療效果。