人源化動物模型在腫瘤免疫治療藥物臨床前研究中的應(yīng)用

宋 征，馬 璟

（中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，國家上海新藥安全評價研究中心，上海益諾思生物技術(shù)有限公司，上海 201203）

腫瘤免疫治療是通過激活自體免疫系統(tǒng)實現(xiàn)抗腫瘤作用的一種治療方式，其應(yīng)用已有較長的歷史，最早可追溯到19世紀(jì)末外科醫(yī)生W illiam COLEY用活細(xì)菌治療腫瘤患者，以延長其生存時間。近年來，藥物研發(fā)人員及醫(yī)藥公司在腫瘤免疫治療藥物的研發(fā)上投注了巨大的精力和財力，大力推進(jìn)了腫瘤免疫治療的發(fā)展。美國FDA于2011年首次批準(zhǔn)免疫檢查點抑制劑抗人細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T-lym phocyte-associated antigen-4，CTLA-4）的抗體Yervoy上市，用于治療黑素瘤；2014年又批準(zhǔn)了2個治療黑素瘤等實體瘤的程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）nivolumab（商品名Opdivo）和pembrolizumab（商品名Keytruda）上市；在2017年批準(zhǔn)了諾華及Kite公司2個嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T療法）上市，揭開了腫瘤免疫治療的新篇章。

在臨床應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，不同患者對于腫瘤免疫治療的效果差異較大。越來越多的證據(jù)表明，由于腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性造成了不同個體的抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)不盡相同［1-2］。腫瘤的微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞及腫瘤周圍的浸潤免疫細(xì)胞、新生血管及內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblast，CAF）和細(xì)胞外基質(zhì)等共同構(gòu)成［3-4］。隨著腫瘤細(xì)胞的增殖，腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)成分和免疫細(xì)胞在微環(huán)境中相互影響，腫瘤細(xì)胞利用機體免疫系統(tǒng)的負(fù)調(diào)控作用，在腫瘤微環(huán)境中建立全方位免疫抑制狀態(tài)，對抗機體抗腫瘤免疫作用，為腫瘤細(xì)胞的生存和發(fā)展創(chuàng)造條件，并最終促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。

經(jīng)典的免疫缺陷動物腫瘤模型（如免疫缺陷小鼠腫瘤移植模型和致癌物誘導(dǎo)的免疫小鼠腫瘤模型）在前期化學(xué)抗腫瘤藥物研發(fā)中發(fā)揮了重要的作用，可用于體內(nèi)藥效學(xué)評價、組織分布研究以及動物對侯選化合物的整體耐受性評價。且適用于多個腫瘤細(xì)胞系，常應(yīng)用于早期藥物研發(fā)中的體內(nèi)藥效篩選。上述免疫缺陷動物腫瘤模型在腫瘤免疫治療藥物的研發(fā)過程中出現(xiàn)了一些限制及缺陷，如①以上模型往往使用體外連續(xù)傳代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行移植，由于腫瘤細(xì)胞株在體外培養(yǎng)環(huán)境中缺乏腫瘤微環(huán)境，丟失了原代腫瘤的特性以及生長特性，因此不能客觀地反映原代腫瘤的情況［5-8］；②移植方法往往為局部皮下注射，局部注射大量的腫瘤細(xì)胞可能導(dǎo)致局部的炎癥反應(yīng)，也可能限制了腫瘤的微環(huán)境；③在局部死亡的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了類似疫苗的作用，也可能影響腫瘤免疫藥物藥效的評價［9-10］；④免疫缺陷小鼠腫瘤模型提供了大量關(guān)于腫瘤生物學(xué)的信息，但由于宿主動物為免疫缺陷動物，因此無法單獨評價以免疫系統(tǒng)為靶點的腫瘤免疫藥物。

由此可見，腫瘤微環(huán)境對于腫瘤免疫藥物的評價非常重要。腫瘤微環(huán)境是一種非常復(fù)雜的、動態(tài)變化的環(huán)境，理想的動物模型應(yīng)盡可能模擬人體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，合適的動物模型有助于免疫腫瘤藥物在臨床前階段安全性、有效性的評價中獲得更有價值的數(shù)據(jù)，具有更高的臨床預(yù)測性。近年來，由于基因編輯技術(shù)及干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步，實驗動物的人源化技術(shù)取得了巨大的進(jìn)步［11-12］。人源化動物模型是指帶有人類功能性基因、細(xì)胞或組織的動物模型［13］。人源化動物的構(gòu)建主要通過2種方式：①基因人源化，即將人類的抗體、病原受體、藥物代謝基因等敲入到大鼠或小鼠的基因組中，使動物可分泌人類抗體、感染人傳染病病原、與人類有相似的藥物代謝行為和毒理表型；②細(xì)胞人源化，即在免疫缺陷動物（如NSG小鼠）中注射一定數(shù)量的人類細(xì)胞或干細(xì)胞，從而獲得人源化動物。本文總結(jié)了目前可用于腫瘤免疫治療藥物研究的人源化動物模型的特點，希望為研究者開展相關(guān)研究工作提供參考。

1 重建人免疫系統(tǒng)動物模型

免疫系統(tǒng)在機體消滅腫瘤細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要的作用。在腫瘤免疫藥物研發(fā)的過程中，臨床前階段的實驗結(jié)果往往不能很好地推測臨床毒性及療效，牽涉到的原因會有很多，但其中最重要的原因就是種屬差異性，嚙齒類動物模型不能很好地模擬人類的免疫系統(tǒng)，特別是T細(xì)胞信號通路、抗原遞呈作用和免疫受體表達(dá)［14-15］。

目前，通過在高度免疫缺陷小鼠體內(nèi)移植來源于人的骨髓、外周血或胚胎組織的造血干細(xì)胞，使小鼠體內(nèi)表達(dá)人類的免疫系統(tǒng)，可獲得重建人免疫系統(tǒng)（human immune system，HIS）小鼠模型。根據(jù)所使用小鼠的品系及所移植的人源細(xì)胞系的不同，每個模型均有各自的優(yōu)缺點［16-23］（表1）。重建HIS的小鼠模型有望成為克服種屬差異的重要模型，并廣泛應(yīng)用于腫瘤免疫藥物的臨床前評價。

重建HIS的小鼠模型具有很多優(yōu)點，但在使用過程中也有一些限制，包括：①移植物抗宿主反應(yīng)（graft-versus-host disease，GVHD）。通過輸入骨髓、外周血單個核細(xì)胞（peripheralblood mononuclear cell，PBMC）建立的人源化小鼠在建模后不同時間均會發(fā)生致命的GVHD，表現(xiàn)為皮膚炎癥和消瘦。這是由于活化的人源性T細(xì)胞攻擊宿主（小鼠）的組織，從而導(dǎo)致宿主血清中人類免疫球蛋白水平（IgG和IgM）升高而產(chǎn)生。②增殖效果不佳。小鼠內(nèi)源性免疫系統(tǒng)會限制移植人源細(xì)胞的擴增，如NSG小鼠具有固有的免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞），會阻礙人源細(xì)胞的增殖［24］，使擴增緩慢。小鼠的蛋白雖不會與人類細(xì)胞交叉反應(yīng)，但人源性的一些蛋白會與小鼠蛋白交叉反應(yīng)，從而影響人源性細(xì)胞的增殖速度。③不完整的HIS。重建HIS小鼠模型無法反映HIS的所有特征，如在人源外周血淋巴細(xì)胞重癥聯(lián)合免疫缺陷（hu-PBL-SCID）和人源SCID再植細(xì)胞嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（hu-SRC-SCID）小鼠模型中，人源T細(xì)胞受限于小鼠H-2d抗原而不能識別HLA限制的抗原，這種缺失使得在使用該類小鼠研究腫瘤的轉(zhuǎn)移時，由于小鼠無法產(chǎn)生人源細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，而對研究腫瘤轉(zhuǎn)移過程有所影響。重建HIS小鼠模型對于外周淋巴結(jié)的特性反映較少，僅人源骨髓/肝細(xì)胞/胸腺重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠（hu-BLT-SCID）模型能部分反映外周淋巴結(jié)的功能，但仍無法反映淋巴結(jié)的生發(fā)中心，因此無法呈現(xiàn)Ig類別轉(zhuǎn)換。

2 重建人免疫系統(tǒng)+人源腫瘤組織異種移植動物模型

約10年前，研究者發(fā)現(xiàn)，可直接將新鮮取得的人體腫瘤組織通過手術(shù)的方式移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，獲得的模型稱為人源腫瘤組織異種移植（patient-derived tumor xenograft，PDX）模型［25-28］。該模型保留了人源腫瘤的微環(huán)境和基本特性以及組織病理學(xué)特征，并一定程度上保留了遺傳學(xué)異質(zhì)性，彌補了腫瘤細(xì)胞系移植模型的一些缺陷［29-30］。該模型也可保留人源腫瘤的臨床和組織病理學(xué)標(biāo)志物、基因表達(dá)以及DNA拷貝數(shù)，這些指標(biāo)均可用于臨床上判斷腫瘤轉(zhuǎn)移的類型［31-32］。該模型的另一優(yōu)勢是具有良好的臨床預(yù)測性，可應(yīng)用于指導(dǎo)腫瘤患者的個性化臨床用藥。有文獻(xiàn)報道，使用人源腫瘤組織移植模型預(yù)測藥物臨床療效為陽性的準(zhǔn)確率達(dá)90%（19/21例），預(yù)測為陰性的準(zhǔn)確率達(dá)97%（57/59 例）［25，31-32］。

表1 常用重建人免疫系統(tǒng)（HIS）小鼠模型的特點

隨著重建HIS動物模型的發(fā)展，有研究者在使用重建HIS動物進(jìn)行PDX，構(gòu)建了重建HIS+PDX動物模型。使用該模型可在重建的患者免疫系統(tǒng)環(huán)境下考察接種該患者腫瘤后，腫瘤與機體相互作用過程中各項生理指標(biāo)的變化，以及腫瘤與免疫系統(tǒng)的相互作用和腫瘤的抵抗性，因此也是目前最接近臨床腫瘤患者情況的模型，可用于個體化檢測患者腫瘤對于不同抗腫瘤藥物治療效果的敏感度。此外，重建HIS+體外培養(yǎng)的人源腫瘤細(xì)胞移植動物模型還可用于藥物臨床前的藥效和毒理實驗，為免疫毒性的評價提供更多信息。

已有研究報道，將體外擴增的人造血干細(xì)胞或人干細(xì)胞祖細(xì)胞，經(jīng)骨髓腔注射至經(jīng)過輻照（如60Coγ射線）后的NSG小鼠體內(nèi)，可建立重建HIS的小鼠模型，之后再將頭部及頸部腫瘤患者的腫瘤組織經(jīng)手術(shù)切除后，皮下移植至構(gòu)建的重建HIS的小鼠側(cè)面體表，以研究人干細(xì)胞祖細(xì)胞與移植的人源腫瘤之間的相互作用［33］。結(jié)果表明，在重建HIS后6個月，在小鼠的外周血中仍可檢測到穩(wěn)定表達(dá)的人源CD3/CD45+細(xì)胞；12個月后，在小鼠的骨髓及脾內(nèi)可見人源T細(xì)胞及B細(xì)胞，證明人干細(xì)胞祖細(xì)胞在移植后仍在持續(xù)擴增，在骨髓細(xì)胞中人源化細(xì)胞的比例占2%～5%。移植的人源骨髓細(xì)胞可浸入皮下移植的人源腫瘤內(nèi)產(chǎn)生α平滑肌肌動蛋白，散在分布于小鼠基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。此外，移植的人干細(xì)胞祖細(xì)胞可產(chǎn)生人源細(xì)胞因子，產(chǎn)生的人源細(xì)胞因子有助于移植的人源腫瘤維持腫瘤原本的特性避免遺傳漂變。與其他模型相比，該模型建立的腫瘤微環(huán)境更加接近臨床患者的情況，是研究腫瘤與免疫系統(tǒng)相互作用的有力工具，可用于探索病理情況下潛在的生物標(biāo)志物或基因信號，還可用于推測臨床聯(lián)合用藥的有效性，及對特殊腫瘤的臨床用藥進(jìn)行指導(dǎo)。據(jù)文獻(xiàn)報道，臨床發(fā)現(xiàn)的某例乳腺癌雌激素受體陽性患者，由于出現(xiàn)雌激素受體變異導(dǎo)致針對該靶點的治療無效，通過采用以上模型針對該患者進(jìn)行其他治療方案的評估，從而指導(dǎo)了該例患者的臨床用藥［34-37］。通過大量腫瘤模型的建立可用于臨床前研究、輔助臨床試驗中生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和與臨床患者做同步用藥試驗及相應(yīng)的回顧性試驗。

但PDX模型在應(yīng)用過程中也有一些限制因素，如用于移植的人源腫瘤必須是通過手術(shù)方式新鮮取下，移植成功率較低（約70%）［31-32］，且移植后的腫瘤成活需較長時間。因此，該模型的應(yīng)用局限于藥物研發(fā)的中后期，可與臨床試驗聯(lián)合進(jìn)行，以更好地協(xié)助指導(dǎo)臨床用藥，探索新的腫瘤治療機制及發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)志物。

3 基因修飾的人源化動物模型

在過去幾十年間，基因工程技術(shù)發(fā)展迅速，已可實現(xiàn)在小鼠基因組內(nèi)進(jìn)行有目的的基因修改，因此基因修飾的人源化動物模型也快速發(fā)展并被廣泛應(yīng)用。基因修飾后的人源化動物在部分或全部細(xì)胞內(nèi)攜帶了人類DNA，人源的序列可調(diào)節(jié)基因表達(dá)及編碼蛋白。目前利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)或基因敲除技術(shù)進(jìn)行小鼠的基因修飾，在腫瘤免疫治療中已得到廣泛應(yīng)用。如當(dāng)腫瘤細(xì)胞與來自不同個體的造血細(xì)胞之間時，人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）的不匹配會引起嚴(yán)重的GVHD或反應(yīng)缺失。Shultz等［38］報道，通過轉(zhuǎn)入HLA匹配的人類造血干細(xì)胞來構(gòu)建HLAⅠ類（A2）轉(zhuǎn)基因NSG小鼠。這些模型小鼠的發(fā)展為研究腫瘤的免疫治療提供了良好的工具。

臨床前實驗階段，常用的嚙齒類動物為大鼠或小鼠，均具有健全的免疫系統(tǒng)。但在進(jìn)行免疫治療藥物的臨床前毒理學(xué)評價時，某些人源化的產(chǎn)品在嚙齒類動物體內(nèi)無效，因而很難采用嚙齒類動物模型進(jìn)行實驗。目前已研發(fā)出轉(zhuǎn)入有人類基因的基因修飾的人源化小鼠模型，可在小鼠體內(nèi)表達(dá)人源蛋白。如PD-1主要表達(dá)于T細(xì)胞及初級B細(xì)胞表面，在免疫應(yīng)答的負(fù)性調(diào)控方面發(fā)揮重要作用，抑制PD-1與其配體的結(jié)合，可使腫瘤細(xì)胞暴露于免疫系統(tǒng)的殺傷視野，進(jìn)而達(dá)到殺傷腫瘤組織及治療癌癥的作用。通過將人PD-1基因轉(zhuǎn)入C57H Black/6小鼠，可使小鼠表達(dá)人源化PD-1蛋白，以評價人源化PD-1抗體的藥效。

4 人源化動物模型的選擇及應(yīng)用

目前免疫治療藥物的發(fā)展日新月異，對動物模型提出了較高的要求。對于一些機制不明的免疫治療產(chǎn)品，不同的動物模型對于藥物作用的響應(yīng)會有非常大的差異，因此選擇合適的動物模型進(jìn)行實驗非常重要。與非免疫治療藥物研究的模型選擇不同，免疫治療除了需要關(guān)注選擇的腫瘤類型、藥物作用機制外，還要關(guān)注腫瘤模型的宿主因素，如所動物種屬對藥物作用的特異性、是否會發(fā)生GVHD、免疫原性和是否有合格的動物供應(yīng)商等等。即使考慮到以上因素，由于免疫治療的個體差異性非常大，建議選擇多個模型進(jìn)行實驗，以獲得不同模型的數(shù)據(jù)。在臨床前及臨床階段，還應(yīng)考慮該模型是否具有可供監(jiān)測的敏感的生物學(xué)標(biāo)志物。

直接針對腫瘤細(xì)胞的免疫治療藥物，如直接調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長的藥物，可考慮使用重建HIS+PDX動物模型，以驗證藥物作用靶點、開展藥效學(xué)和藥動學(xué)實驗、以及發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物等。目前在臨床前的藥物作用機制及藥效學(xué)研究過程中，重建HIS動物+PDX模型是最接近腫瘤患者病理生理特征的動物模型，也是未來新的動物模型發(fā)展的重要方向。

對于免疫檢查點抑制劑類藥物，免疫缺陷動物往往不能體現(xiàn)其靶點相關(guān)的毒性，而使用動物源的替代產(chǎn)品一方面對藥學(xué)部分提出很高的要求，另一方面也需有足夠的實驗結(jié)果證明動物源替代產(chǎn)品的結(jié)果對于臨床毒性預(yù)測的意義。因此在目前階段，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建的人源化動物模型是一個相對比較理想的選擇。如何保持動物模型本身免疫系統(tǒng)的完整性及減少動物個體差異性，是該模型下一步需要解決的問題。在選擇動物供應(yīng)商時，需要關(guān)注其模型動物的背景數(shù)據(jù)（如人源化基因表達(dá)的比例及其隨時間變化的關(guān)系、動物生長曲線、存活期、不同周齡動物各項臨床病理指標(biāo)的背景數(shù)據(jù)），以選擇個體差異較少的動物模型，從而獲得差異較小、準(zhǔn)確度較高的動物實驗數(shù)據(jù)。

對于目前不斷產(chǎn)生的新的細(xì)胞治療產(chǎn)品，在選擇動物模型時需要針對細(xì)胞治療產(chǎn)品的作用機制及特點進(jìn)行選擇。對于特殊給藥途徑的細(xì)胞治療產(chǎn)品需考慮動物和人的解剖學(xué)差異，以及藥物到達(dá)作用部位的可行性。如在CAR-T治療產(chǎn)品臨床前安全性評價中，需要考察CAR-T增殖所帶來的靶點相關(guān)毒性以及脫靶毒性，可通過不同模型的組合實驗達(dá)到評價目的，即采用人源化小鼠荷瘤模型考察CAR-T治療產(chǎn)品的靶點毒性，同時采用免疫缺陷動物考察脫靶毒性。在實驗設(shè)計中可將藥效、組織分布、毒理等多個評價目的整合在一個實驗中，作為概念驗證實驗（proof of concept）對新的免疫治療藥物臨床前安全性進(jìn)行綜合性評價。

人源化動物的構(gòu)建技術(shù)還在不斷發(fā)展中，各個實驗室及動物供應(yīng)商對于新模型的應(yīng)用需特別注意背景數(shù)據(jù)的累積。如在應(yīng)用人源化動物模型進(jìn)行臨床前毒理學(xué)評價時，需充分考慮到模型動物個體差異以及新模型動物的特點，在進(jìn)行實驗設(shè)計時，通過適當(dāng)放大動物例數(shù)、設(shè)立不同的對照組等方法科學(xué)地評價腫瘤免疫治療藥物的安全性。

不同類型人源化小鼠模型有其不同的特點、應(yīng)用階段和范圍。在臨床前評價階段，尚無一個動物模型是萬能的，需根據(jù)藥物的特點選擇不同的動物模型，綜合評價藥物的安全性及有效性，科學(xué)地預(yù)測藥物臨床應(yīng)用的安全性。

5 結(jié)語

新技術(shù)在動物模型構(gòu)建中的應(yīng)用為腫瘤免疫治療研究帶來巨大的發(fā)展。人源化動物模型在研究免疫治療藥物的作用機制、藥效篩選和毒性評價等方面具有較明顯的優(yōu)勢，如可表達(dá)人源化蛋白、人細(xì)胞因子、模擬HIS、體現(xiàn)HIS下移植的人源化腫瘤與免疫系統(tǒng)及藥物之間的相互作用，甚至可應(yīng)用于臨床指導(dǎo)患者個體化用藥的研究。但目前可用的人源化動物的類型還較為單一，HIS重建程度也有待完善。如何構(gòu)建與HIS相似度更高的模型動物，同時提高人源化動物的質(zhì)量和產(chǎn)量，完善模型動物背景數(shù)據(jù)庫，并建立更健全的動物檢驗標(biāo)準(zhǔn)，都是需要不斷努力解決的問題。希望在不遠(yuǎn)的將來有更好的動物模型產(chǎn)生，為新藥研發(fā)及臨床應(yīng)用研究助力。