毛竹快速生長期莖稈不同節(jié)間碳水化合物代謝的變化

翟建云，孫建飛，馬元丹，卜柯麗，王柯楊，溫國勝，高海波，高 巖，張汝民

(1.浙江農(nóng)林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300； 2.臨沂大學 生命科學學院，山東 臨沂 276000)

碳水化合物是一類廣泛存在于自然界中的重要能量來源，參與植物細胞的組成和多種生命活動，為植物的生長發(fā)育提供能量、結(jié)構物質(zhì)和信號物質(zhì)，在植物體內(nèi)的存在形式主要有2種：非結(jié)構性碳水化合物主要參與植物的生命代謝；結(jié)構性碳水化合物主要用于植物的形態(tài)建成[1-3]。劉洋等[4]研究甜高粱(Sorghumbicolor)莖稈糖分代謝發(fā)現(xiàn)，隨節(jié)間升高葡萄糖和果糖呈“高—低—高”的變化趨勢，蔗糖無顯著變化規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)下胚軸中，蔗糖誘導植物生長素的運輸和信號轉(zhuǎn)導，從而促進擬南芥的生長[5]。Magel等[6]研究竹類Sasapalmata生長中莖稈可溶性碳水化合物和酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase, AI)發(fā)現(xiàn)，己糖質(zhì)量分數(shù)與細胞伸長和膨脹有關，與細胞壁結(jié)合的AI活性高可促進莖稈生長。研究不同生長階段甘蔗(Saccharumofficinarum)蔗糖積累發(fā)現(xiàn)，甘蔗組織中糖的合成與分解是由蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)、中性轉(zhuǎn)化酶(neutral invertase, NI)和AI進行協(xié)調(diào)的[7]。Huber等[8]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPS活性與蔗糖質(zhì)量分數(shù)之間存在正比關系，與淀粉合成之間存在呈負相關，表明SPS能夠?qū)φ崽呛偷矸壑g碳的分配產(chǎn)生影響。研究栽種期至展葉期蘭州百合(Liliumdavidiivar.willmottiae)和亞洲百合(LiliumAsiatic hybrids)鱗莖發(fā)現(xiàn)，發(fā)育過程中淀粉的積累與淀粉磷酸化酶(starch phosphorylase, SP)存在正比關系，說明鱗莖淀粉的合成和SP相關[9]。毛竹(Phyllostachysedulis)是隸屬禾本科的竹類植物，是浙江及其周邊地區(qū)重要的竹種，具有良好的經(jīng)濟、生態(tài)和社會效益[10]。毛竹生長快速，只需2個月左右即可完成稈形生長，碳水化合物能為其莖稈快速生長提供能量和結(jié)構材料，對毛竹快速生長的研究主要涉及組織結(jié)構、光合作用、內(nèi)源激素和分子生物等方面[11-14]，但對毛竹莖稈中碳水化合物代謝研究較少[15]。因此，本研究以毛竹快速生長期的莖稈為材料，研究了毛竹莖稈不同節(jié)間碳水化合物質(zhì)量分數(shù)及相關代謝酶活性的變化，為進一步研究毛竹快速生長提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

試驗材料采自浙江省杭州市臨安區(qū)的現(xiàn)代毛竹示范基地(29°56′～30°27′N，118°51′～119°52′E)。該地屬于亞熱帶季風氣候，雨水充沛，年平均氣溫為16.4 ℃，1月平均氣溫為3.4 ℃，7月平均氣溫為28.1 ℃。年降水量為1 628.6 mm，年日照時數(shù)為1 847.3 h。森林覆蓋率為76.5%，采樣地土質(zhì)為紅壤。

1.2 試驗設計

在2016年4月至5月毛竹快速生長階段，于上午10:00選取生境條件一致、生長狀況良好和高度(3±0.2)m的毛竹筍竹。從靠近地面的基部伐倒，挖出竹篼，并對竹篼中間部位進行取樣，地上部分由莖稈基部起每間隔2節(jié)依次取樣。將所取竹篼編號為0，地上部分節(jié)間按基部到頂部依次編號為1、4、7、10、13、16、19、22。取樣后立即置于液氮中冷凍，并置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。選取5株筍竹，1株為1個處理，5次重復。

1.3 測定方法

1.3.1可溶性糖測定 稱取0.5 g植物樣品，研磨至勻漿，加蒸餾水9 mL，沸水浴提取10 min，不斷攪拌。冷卻，離心(3000 r·min-1, 5 min)，取上清液。蔗糖、果糖和葡萄糖分別采用果糖和蔗糖試劑盒(南京建成科技有限公司生產(chǎn))、葡萄糖試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司)測定，具體方法按說明書操作。

1.3.2淀粉測定 將上述可溶性糖提取后的沉淀用體積分數(shù)為80%乙醇沖洗1遍，加蒸餾水3 mL，攪拌均勻，沸水15 min。冷卻后，加入冷的高氯酸(9.2 mmol·L-1) 4 mL，攪拌提取20 min，蒸餾水定容至25 mL，混勻，離心(3 000 r·min-1, 10 min)。取上清液，采用蒽酮硫酸法測定。

圖1 毛竹不同節(jié)間碳水化合物質(zhì)量分數(shù)Fig.1 The carbohydrate content in different internodes of Ph. edulis

1.3.3纖維素測定 將淀粉提取后的沉淀用蒸餾水沖洗2遍，加入體積分數(shù)為60%硫酸2 mL，冰浴提取30 min，定容至25 mL，3 000 r·min-1離心10 min。取上清液，參照Chen等[16]的方法測定。

1.3.4酶活性測定 稱取植物樣品0.5 g，冰浴研磨，用Tris-HCl(50 mmol·L-1, pH 7.0)提取液提取定容至5 mL，10 000 r·min-1離心 10 min(4 ℃)，上清液為酶提取液。SPS、蔗糖合成酶(sucrose synyhase, SS)和轉(zhuǎn)化酶(invertase, Inv)活性測定參照King等[17]的方法；SP和支鏈淀粉酶(pullulanase, PUL)活性測定參照Zeeman等[18]的方法。蛋白質(zhì)測定參照Bradford的方法[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均取5次重復的平均值±標準誤差。利用Origin 9.0軟件(OriginLab公司, 美國)進行統(tǒng)計分析和作圖，采用One-Way ANOVA對莖稈各個節(jié)間碳水化合物質(zhì)量分數(shù)及相關代謝酶活性分別進行檢驗，并用SPSS軟件進行相關性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性糖質(zhì)量分數(shù)的變化

毛竹莖稈各個節(jié)間內(nèi)可溶性糖變化結(jié)果見圖1a。竹篼(0)中蔗糖質(zhì)量分數(shù)最高，下部第1節(jié)間蔗糖比竹篼低了32.8%(P<0.01)；隨著節(jié)間的升高，蔗糖質(zhì)量分數(shù)下降顯著，第7節(jié)間比第1節(jié)間降低了35.9%(P<0.01)，第7節(jié)間至頂部呈略有波動地下降。葡萄糖質(zhì)量分數(shù)在竹篼中最高，基部至頂部總體呈下降趨勢，第16節(jié)間至頂部變化略有波動。莖稈下部第1節(jié)間內(nèi)果糖質(zhì)量分數(shù)最高，比竹篼高了54.1%(P<0.01)，隨節(jié)間的升高，質(zhì)量分數(shù)顯著下降，第10節(jié)間比第1節(jié)間低了41.5%(P<0.01)，而第10節(jié)間到頂部差異不顯著。

圖2 毛竹不同節(jié)間碳水化合物代謝酶活性Fig.2 Activities of carbohydrate metabolizing enzymes in different internodes of Ph. edulis

2.2 淀粉和纖維素質(zhì)量分數(shù)變化

毛竹莖稈不同節(jié)間內(nèi)淀粉和纖維素變化結(jié)果見圖1b。莖稈第1節(jié)間淀粉質(zhì)量分數(shù)最低，比竹篼低了30.3%(P<0.01)。隨著節(jié)間的升高，淀粉質(zhì)量分數(shù)總體呈上升趨勢，基部至第10節(jié)間差異不顯著，第10節(jié)間至頂部則顯著上升，第22節(jié)間比第10節(jié)間高出71.3%(P<0.01)。毛竹莖稈下部第1節(jié)間內(nèi)纖維素最高，是竹篼的1.9倍(P<0.01)；基部到頂部纖維素不同程度地降低，基部至第10節(jié)間下降顯著，第10節(jié)間比第1節(jié)間低了51.6%(P<0.01)，而第10節(jié)間至莖稈頂部變化較小。

2.3 蔗糖代謝酶活性的變化

毛竹莖稈不同節(jié)間內(nèi)SS、SPS和Inv酶活性變化見圖2a。SS和SPS酶活性在竹篼中最高，分別是下部第1節(jié)間的1.6、1.7倍(P<0.01)。隨著節(jié)間的升高，SS酶活性顯著下降，第7節(jié)間比第1節(jié)間低了56.9%(P<0.01)，而第7節(jié)間至頂部略有波動地下降。從莖稈基部至頂部，SPS酶活性下降顯著，第13節(jié)間比第1節(jié)間低了87.8%(P<0.01)，第13節(jié)間至頂部酶活性逐漸趨于0。毛竹莖稈中，Inv酶活性隨著節(jié)間的升高呈現(xiàn)上升趨勢，第4節(jié)間酶活性達到最高，之后酶活性總體呈下降趨勢。

2.4 淀粉代謝酶活性的變化

毛竹莖稈不同節(jié)間內(nèi)PUL和SP酶活性變化見圖2-B，莖稈內(nèi)PUL和SP酶活性整體較低，竹篼內(nèi)PUL和SP酶活性最高。下部第1節(jié)間PUL酶活性比竹篼低了52.4%(P<0.01)，從莖稈基部到頂部，酶活性顯著降低，第10節(jié)間比第1節(jié)間下降了85.3%(P<0.01)，而第10節(jié)間至頂部酶活性逐漸趨于0。毛竹莖稈中，竹篼中SP的酶活性比第1節(jié)間高出2.3倍(P<0.01)，隨節(jié)間的升高活性逐漸上升，第4節(jié)間活性比第1節(jié)間高出45.5%(P<0.01)，之后活性呈總體下降，其中第13節(jié)間至頂部活性趨于0。

2.5 相關性分析

2.5.1碳水化合物相關性分析 表1毛竹莖稈內(nèi)蔗糖與葡萄糖之間存在極顯著正相關(P<0.01)，與其他碳水化合物之間相關性均未達到顯著；果糖與葡萄糖呈顯著正相關(P<0.05)，與纖維素存在極顯著正相關(P<0.01)；葡萄糖與纖維素之間存在顯著正相關(P<0.05)；淀粉與果糖、葡萄糖之間均存在顯著負相關(P<0.05)，與纖維素質(zhì)量分數(shù)之間負相關達到極顯著(P<0.01)。

表1 毛竹節(jié)間碳水化合物質(zhì)量分數(shù)的相關性

說明：*表示在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關；**表示在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關

2.5.2碳水化合物質(zhì)量分數(shù)與酶活性相關性分析 表2毛竹不同節(jié)間碳水化合物質(zhì)量分數(shù)與酶活性的相關性分析顯示：毛竹莖稈內(nèi)蔗糖、葡萄糖質(zhì)量分數(shù)與SS、SPS酶活性均呈極顯著正相關(P<0.01)，與Inv酶活性的相關性均不顯著；果糖與Inv呈顯著正相關(P<0.05)，與SS、SPS呈正相關但未達到顯著。毛竹筍竹莖稈內(nèi)淀粉質(zhì)量分數(shù)與PUL、SP酶活性的變化均呈負相關，但未達到顯著。

表2 毛竹節(jié)間碳水化合物質(zhì)量分數(shù)與酶活性的相關性

說明：*表示在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關；**表示在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關

3 討論

碳水化合物是植物體內(nèi)能量代謝和物質(zhì)代謝的基礎，主要參與植物生長發(fā)育過程中碳素積累、能量供給等生理生化過程[20]。蔗糖是運輸碳水化合物的主要形式之一，能引起細胞分化和成熟，己糖能促使細胞分裂和伸長；淀粉是主要的儲存形式，以滿足植物未來的生長需求[21-22]。Sarah等[23]對生長期甘蔗莖稈研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖和總糖質(zhì)量分數(shù)隨莖稈節(jié)間的升高呈降低趨勢。研究生長期郁金香(Tulipagesneriana)匍匐莖碳水化合物的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在匍匐莖發(fā)育過程中可溶性糖呈下降趨勢，淀粉呈上升趨勢[24]。卞云龍等[25]對不同品種玉米(Zeamays)莖稈糖分布的研究發(fā)現(xiàn)，糖質(zhì)量分數(shù)從莖稈基部到頂部呈現(xiàn)增加趨勢。本研究結(jié)果表明，竹篼內(nèi)可溶性糖質(zhì)量分數(shù)高于莖稈，可能是由于筍竹快速生長時期光合能力較弱，其生長發(fā)育所需的大部分養(yǎng)分原料來自周圍的成竹，成竹通過地下莖將可溶性糖轉(zhuǎn)運到筍竹的竹篼中，在竹篼內(nèi)暫貯和周轉(zhuǎn)，以滿足毛竹快速生長階段高生長和生理代謝的需求[26-27]。隨著節(jié)間的升高，蔗糖、葡萄糖和果糖整體呈下降趨勢，其中蔗糖質(zhì)量分數(shù)的變化范圍與程路蕓等[15]的研究結(jié)果不同，可能是因為采樣時間和所采毛竹的高度不一致，測出的質(zhì)量分數(shù)不同；上午10:00左右，毛竹的整體生長速度慢于夜間，成竹轉(zhuǎn)運到竹篼中的可溶性糖以蔗糖的形式運輸?shù)角o稈，由基部往上運輸，基部蔗糖積累較多；中下部生長快速的節(jié)間需要消耗能量，可溶性糖水平相對較高。隨著節(jié)間的升高，淀粉呈逐漸上升趨勢，與程路蕓等[15]研究發(fā)現(xiàn)淀粉質(zhì)量分數(shù)下降的趨勢不同。這可能是由于毛竹快速生長過程中各節(jié)間生長開始和停止的時間不同，生長速度也不一致，對淀粉的需求程度不同；中下部莖稈生長較快，淀粉大量降解為可溶性糖主要用于莖稈細胞的快速分裂和伸長；上部生長緩慢，淀粉利用相對較少，蔗糖降解的單糖即可滿足基本的生理代謝活動，且本實驗中節(jié)間取樣取至莖稈頂部，而程路蕓等[15]上部節(jié)間只取了中間一節(jié)，并未表明靠近頂部的節(jié)間內(nèi)淀粉質(zhì)量分數(shù)。

纖維素是毛竹細胞壁的重要結(jié)構成分，在毛竹快速生長階段，纖維素合成是毛竹結(jié)構和形態(tài)建成必須的過程。劉波研究發(fā)現(xiàn)，0.68 m毛竹中部的纖維細胞進行初生壁纖維素沉積，6.90 m毛竹中部進行次生壁第1層的纖維素累積[28]。對苦竹的研究表明，1年生苦竹的莖稈上部纖維素與中部和基部相比顯著降低[29]。本研究表明，莖稈基部到第10節(jié)間纖維素顯著下降，之后差異不顯著，說明毛竹莖稈發(fā)育、成熟是從基部到頂部順次完成的，靠近基部的節(jié)間發(fā)育更為成熟，纖維素沉積較多[30]。實驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，纖維素與淀粉質(zhì)量分數(shù)之間呈顯著負相關，與葡萄糖和果糖質(zhì)量分數(shù)之間呈顯著正相關，表明中下部莖稈內(nèi)淀粉分解為單糖，靠近基部的幾個節(jié)間發(fā)育較為成熟，主要為次生壁纖維素的形成提供底物；中部主要進行節(jié)間的快速伸長，纖維素形成較少；上部發(fā)育較晚，主要進行初生生長，纖維素質(zhì)量分數(shù)低且差異較小[28]。

在整個碳水化合物合成和分解過程中，同時需要多種酶的參與[31]。植物體內(nèi)，蔗糖的合成與降解包括多個酶促反應，涉及到多種酶，其中主要關鍵酶為Inv、SS和SPS。蔗糖可被Inv催化降解為己糖，或被SS催化分解為果糖與UDPG，為植物生長提供能量，為淀粉和纖維素提供合成底物；而己糖也可在SS或SPS的催化作用下合成為蔗糖。Krishnan等[32]研究表明高的Inv酶活性有利于將果實中的蔗糖分解成己糖，為合成纖維素、淀粉等物質(zhì)提供原料和能量。在本研究中，毛竹莖稈內(nèi)Inv酶活性較高，且第4節(jié)間到第7節(jié)間酶活性相對更高，說明這幾個莖稈節(jié)間處于顯著伸長期，需要消耗大量的能量，部分蔗糖在運輸過程中被降解為己糖，為節(jié)間細胞分裂和伸長、呼吸消耗等生理代謝活動提供能量。研究結(jié)果分析表明，Inv活性與蔗糖質(zhì)量分數(shù)之間存在不顯著負相關，與果糖質(zhì)量分數(shù)之間呈顯著正相關，說明在蔗糖代謝中Inv起到一定的分解作用，但不是主要的調(diào)控酶。Verma等[33]對甘蔗莖稈內(nèi)蔗糖積累研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖質(zhì)量分數(shù)與SPS活性之間存在相關關系，與SS活性之間呈負相關，成熟節(jié)間SPS活性高于未成熟節(jié)間，SS活性則相反。本研究結(jié)果表明，SPS和SS活性隨著節(jié)間的升高而下降，與蔗糖下降趨勢相同，其中SS酶活的變化與Verma等[33]的結(jié)論不同，可能是因為在毛竹莖稈中SS主要作用于蔗糖的合成，與SPS共同催化蔗糖的合成。基部節(jié)間SS和SPS酶活性較高，表明基部發(fā)育較成熟，淀粉和蔗糖降解的己糖在SPS和SS作用下重新合成蔗糖，往莖稈中上部運輸；其中較高的SS活性既可以降解蔗糖為纖維素合成提供UDPG，也可以合成蔗糖，莖稈下部發(fā)育較為成熟，其合成速率高于降解速率，與SPS一同將單糖合成蔗糖運輸?shù)街猩喜縖4,34]。相關分析發(fā)現(xiàn)，SPS和SS活性與蔗糖質(zhì)量分數(shù)之間分別存在極顯著正比關系，說明毛竹莖稈內(nèi)SPS和SS在蔗糖代謝過程中可能起著主要的調(diào)節(jié)作用。

PUL和SP屬于淀粉代謝酶，PUL能夠?qū)Ｒ恍运庵ф湹矸?；SP對淀粉的催化作用是可逆的，既可以合成淀粉，也可以降解淀粉[35-36]。本實驗中，SP酶活性變化趨勢與淀粉質(zhì)量分數(shù)變化趨勢不同，和孫紅梅等[9]發(fā)現(xiàn)百合鱗莖發(fā)育階段SP酶活性與淀粉質(zhì)量分數(shù)均下降不一致，說明毛竹快速生長時期SP與淀粉降解有關。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)：PUL和SP酶活性相對較低，隨節(jié)間的升高均呈總體下降趨勢，與淀粉呈上升趨勢相反，說明中下部生長快速，淀粉可能進行了降解；而SP酶活性在第4節(jié)間到第10節(jié)間相對較高，表明這幾個節(jié)間莖稈生長相對較快，需要消耗的可溶性糖多，淀粉降解較多；上部酶活性趨于0，說明上部節(jié)間生長緩慢，可溶性糖需求較低，淀粉降解較少。相關性分析表明，PUL和SP酶活性和果糖、葡萄糖質(zhì)量分數(shù)均呈正相關，說明莖稈內(nèi)一部分單糖來源于淀粉降解，PUL和SP催化淀粉分解為己糖，為纖維素沉積提供底物，以及莖稈細胞的快速分裂和伸長提供能量；而PUL和SP活性與淀粉質(zhì)量分數(shù)之間存在不顯著負相關，表明PUL和SP對淀粉的分解可能不起主要作用。

綜上所述，毛竹莖稈內(nèi)碳水化合物質(zhì)量分數(shù)隨節(jié)間升高呈有規(guī)律性變化，表明莖稈的發(fā)育成熟是從基部到頂部順次完成的?；抗?jié)間發(fā)育較為成熟，纖維素沉積較多；中下部生長快速的節(jié)間，需求能量較多，可溶性糖相對較高；筍竹上部由于發(fā)育較晚，節(jié)間伸長較慢，對可溶性糖的需求量較低，淀粉利用相對較少。竹篼在碳水化合物的運輸中起著暫時儲藏和周轉(zhuǎn)作用，為毛竹的快速生長提供所需的能量和結(jié)構原料。相關性分析表明，SS和SPS可能是碳水化合物代謝的主要調(diào)控酶。