超聲波輔助提取石崖茶總黃酮工藝優(yōu)化

王 仲，金琦芳，段振華

（賀州學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，廣西 賀州 542800）

石崖茶是山茶科楊桐屬亮葉楊桐（Adinandra nitida）嫩梢制成的代茶，在廣西多地有分布，民間用來(lái)消炎、解毒、殺菌、鎮(zhèn)痛等[1-2]。現(xiàn)代研究表明，石崖茶抗氧化能力優(yōu)于普通綠茶，其中茶湯中黃酮化合物起到較大作用[3-4]。且石崖茶比普通茶葉咖啡因含量低，低至1.74%，可作為因咖啡因引起中樞神經(jīng)興奮而失眠的飲茶人群良好的替代茶飲[5-6]。研究表明石崖茶中總黃酮含量可高達(dá)28.4%，是目前已知黃酮含量最高的植物，具有抗氧化[7-8]、清除自由基[9-10]、抗菌[8,11]、降血脂[12]、降血糖[13]和抗腫瘤[7,14]等保健和藥用價(jià)值。目前，石崖茶中黃酮類(lèi)化合物成分鑒定和含量測(cè)定方法主要有液質(zhì)聯(lián)用[15-16]、HPLC法[17]和UPLC法[18]等，雖然這些方法檢測(cè)結(jié)果精確度較高，但是對(duì)大型試驗(yàn)儀器的依賴(lài)性大。本研究參考其他植物超聲波輔助乙醇浸提總黃酮工藝[19-20]，優(yōu)化石崖茶總黃酮提取工藝，得出一種儀器要求簡(jiǎn)單、提取效率高的總黃酮提取工藝，并比較廣西金秀、昭平和桂平地區(qū)石崖茶總黃酮含量，為進(jìn)一步推廣和利用該優(yōu)異植物資源提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為石崖茶春茶，產(chǎn)自金秀、桂平和昭平地區(qū)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑和儀器

所有化學(xué)試劑均為分析純，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC＞98%）購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。主要儀器有722型分光光度計(jì)、循環(huán)水式真空泵、高速多功能粉碎機(jī)、電子天平、超聲波清洗器、電熱恒溫干燥箱、40目篩等。

1.2.2 總黃酮的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制。精密稱(chēng)取20.0 mg于120℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加140 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，微熱水浴使溶解，放置至室溫后，加70%的乙醇定容至200 mL，搖勻，制得0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。精密量取0.0 mL、10.0 mL、15.0 mL、20.0 mL、25.0 mL和30.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液于50 mL容量瓶中，用濃度為70%的乙醇溶液補(bǔ)充至30 mL。各精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，充分搖勻，靜止6 min后各精確加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，充分搖勻，靜止6 min后各加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，用濃度為70%的乙醇溶液定容至刻度，充分搖勻，靜置15 min后使用紫外分光光度計(jì)在510 nm處測(cè)量吸光度值，以吸光值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of tutin

總黃酮的測(cè)定。準(zhǔn)確稱(chēng)取石崖茶粉末1.0 g，以乙醇溶液為溶劑，經(jīng)超聲波輔助提取，抽濾后取濾液備用。采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法測(cè)定總黃酮的吸光度值[21]，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮的含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

考察在乙醇濃度50%、超聲時(shí)間20 min和超聲溫度30℃條件下，不同料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60對(duì)總黃酮提取率的影響；考察在料液比1∶50、超聲時(shí)間20 min和超聲溫度30℃條件下，不同乙醇濃度50%、60%、70%、80%和90%對(duì)總黃酮提取率的影響；考察在乙醇濃度50%、料液比1∶50和超聲溫度30℃條件下，不同超聲時(shí)間10 min、20 min、30 min、40 min和50 min對(duì)總黃酮提取率的影響；考察在乙醇濃度50%、料液比1∶50和超聲時(shí)間20 min條件下，不同超聲溫度25℃、35℃、45℃、55℃和65℃對(duì)總黃酮提取率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)L9（34）設(shè)計(jì)（表2），考察料液比（A）、乙醇濃度（B）、超聲時(shí)間（C）和超聲溫度（D）四因素對(duì)總黃酮提取率的影響。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for Adinandra nitida fl avonoids extraction

1.2.5 不同產(chǎn)地石崖茶總黃酮含量測(cè)定

采用最優(yōu)提取方案測(cè)定并比較廣西金秀、桂平和昭平三個(gè)產(chǎn)地的石崖茶總黃酮含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)石崖茶總黃酮提取率的影響

由圖2可看出，隨著溶劑用量增大，石崖茶中總黃酮提取率增大，在料液比為1∶50時(shí)提取率最高，提取率為26.2%，繼續(xù)增加溶劑用量提取率呈下降趨勢(shì)；提取率下降可能是由于增大溶劑用量使相同超聲時(shí)間內(nèi)黃酮提取的超聲輔助效果減弱，導(dǎo)致提取不充分。因此，確定1∶50作為單因素試驗(yàn)中的最適料液比，并選取料液比1∶40、1∶50和1∶60這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 料液比對(duì)石崖茶總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of Adinandra nitida fl avonoids

2.1.2 乙醇濃度對(duì)石崖茶總黃酮提取率的影響

由圖3可看出，乙醇濃度在50%～70%范圍內(nèi)時(shí)，石崖茶總黃酮提取率隨乙醇濃度增大而增大，乙醇濃度為70%時(shí)，提取率達(dá)到最高（27.55%）；隨著乙醇濃度進(jìn)一步增大，提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，確定合適的乙醇濃度在70%左右，選取乙醇濃度60%、70%和80%這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 乙醇濃度對(duì)石崖茶總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of Adinandra nitida fl avonoids

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)石崖茶總黃酮提取率的影響

由圖4可看出，超聲時(shí)間為30 min時(shí)，提取率最大，為27.76%；再延長(zhǎng)超聲時(shí)間，提取率呈下降趨勢(shì)。分析認(rèn)為，超聲時(shí)間對(duì)石崖茶總黃酮提取率有明顯影響，超聲時(shí)間短時(shí)，提取不充分；超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)使黃酮遭到破壞，使提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，確定合適的超聲時(shí)間在30 min左右，后續(xù)試驗(yàn)中選取超聲時(shí)間20 min、30 min和40 min這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)石崖茶總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of Adinandra nitida fl avonoids

2.1.4 超聲溫度對(duì)石崖茶總黃酮提取率的影響

由圖5可以看出，溫度對(duì)提取率有較大的影響，隨著超聲溫度的升高，提取率先升高，然后降低，在55℃時(shí)提取率達(dá)到峰值（27.01%）。分析認(rèn)為，可能是一些黃酮類(lèi)物質(zhì)在過(guò)高的溫度條件下會(huì)隨著溫度的繼續(xù)升高而被破壞，從而導(dǎo)致黃酮的提取率降低。因此，確定合適的超聲溫度在55℃左右，后續(xù)試驗(yàn)中選取超聲溫度45℃、55℃和65℃這3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖5 超聲溫度對(duì)石崖茶總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield ofAdinandra nitida fl avonoids

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2極差分析結(jié)果可知，試驗(yàn)考察的影響石崖茶總黃酮提取率的4個(gè)因素中，影響大小為：料液比＞超聲溫度＞超聲時(shí)間＞乙醇濃度。由各因素的極差及均值綜合分析可得，超聲輔助提取石崖茶總黃酮的最優(yōu)提取方案應(yīng)為A1D2C2B2，即料液比1∶40、乙醇濃度70%、超聲時(shí)間30 min和超聲溫度55℃。正交試驗(yàn)中的試驗(yàn)2恰為最佳方案因素組合，是正交試驗(yàn)9組試驗(yàn)中最好的結(jié)果。進(jìn)一步根據(jù)最優(yōu)方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)5次，得到石崖茶總黃酮平均提取率為30.32%，RSD=0.34%。結(jié)果表明，優(yōu)化后的提取方案重復(fù)性好，提取率優(yōu)化效果明顯。因此，本試驗(yàn)優(yōu)化方案可用于石崖茶總黃酮的提取。

表2 總黃酮提取率影響因素正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Flavonoids extraction rate factors orthogonal test results

2.3 不同產(chǎn)地石崖茶總黃酮含量比較

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化后的提取方案，提取測(cè)定廣西昭平、桂平和金秀三個(gè)產(chǎn)區(qū)石崖茶產(chǎn)品的總黃酮含量。測(cè)定結(jié)果（圖6）表明，昭平、桂平和金秀石崖茶總黃酮含量存在差異，其中產(chǎn)自昭平的石崖茶總黃酮含量為30.4%，產(chǎn)自桂平的石崖茶總黃酮含量為27.4%，產(chǎn)自金秀的石崖茶總黃酮含量為25.6%。差異顯著性分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)地來(lái)源的石崖茶總黃酮含量之間存在極顯著差異。

圖6 不同產(chǎn)地石崖茶總黃酮含量比較Fig. 6 Comparison of the total fl avonoids content of Adinandra nitida from different areas

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取石崖茶總黃酮，以石崖茶總黃酮提取率為指標(biāo)，分別進(jìn)行料液比、乙醇濃度、超聲時(shí)間和超聲溫度4個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率影響的研究。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，分析得出石崖茶總黃酮的超聲波輔助提取工藝中4個(gè)因素對(duì)石崖茶總黃酮提取率影響大小為：料液比＞超聲溫度＞超聲時(shí)間＞乙醇濃度，提取工藝最優(yōu)條件為：料液比1∶40、乙醇濃度70%、超聲時(shí)間30 min、超聲溫度55℃。該石崖茶總黃酮提取工藝具有提取率高、提取時(shí)間短及操作簡(jiǎn)單方便等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)比較昭平、桂平和金秀三個(gè)產(chǎn)地的石崖茶總黃酮含量，其中昭平的含量最高，具有潛在的推廣種植與開(kāi)發(fā)利用優(yōu)勢(shì)。