鵝細(xì)小病毒基因組結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展

曹 楠 楊舒展 黃冠雄 郭思璇 曾依翎 李冰心 田允波 許丹寧

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510225；3.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，廣東 廣州 510623）

鵝細(xì)小病毒（Goose Parvovirus Virus，GPV）可侵染3～20日齡雛鵝和雛番鴨小鵝，造成出血性、纖維素性和滲出性腸炎，是雛鵝和雛番鴨的一種嚴(yán)重傳染?。?］。揚(yáng)州大學(xué)的方定一教授于1956年首次發(fā)現(xiàn)了GPV并對其做了詳細(xì)的研究［2］。此后，日本［3］、英國［4］、匈牙利［5］、瑞典［6］、法國［7］和美國［8］等許多國家陸續(xù)報(bào)道了該病。與此同時(shí)，該病在我國福建［9］、江蘇［10］、四川［11］、山東［12］等主要的水禽養(yǎng)殖地區(qū)廣泛流行，給水禽養(yǎng)殖行業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)外很多學(xué)者都對其展開了研究，經(jīng)過幾十年的不斷探索，GPV的分子結(jié)構(gòu)及相應(yīng)的生物學(xué)特點(diǎn)逐漸被研究透徹。

1 鵝細(xì)小病毒病原學(xué)

GPV屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，病毒粒子呈圓形或六角形，外直徑為20～25 nm，內(nèi)直徑約為15 nm，外殼厚約5 nm，可以形成二十面體對稱的空間結(jié)構(gòu)［13］。通過X射線衍射發(fā)現(xiàn)，GPV病毒粒子每個(gè)5重對稱軸上均含有一個(gè)中空圓柱體，并且有溝槽環(huán)繞圓柱體的周圍。此外，GPV每個(gè)2重對稱軸上有一個(gè)凹窩，每個(gè)3重對稱軸上有一個(gè)突起，這個(gè)突起是病毒對宿主嗜性的決定因素［14］。GPV病毒粒子表面沒有囊膜結(jié)構(gòu)，單鏈線狀DNA構(gòu)成病毒的核酸結(jié)構(gòu)，外部由3種結(jié)構(gòu)蛋白組成病毒的衣殼。感染性GPV顆粒的沉降系數(shù)為110 S，而缺少DNA的非感染性GPV粒子則為65 S。GPV對外界環(huán)境有著較強(qiáng)抵抗能力，在56℃條件下作用1 h仍然具有活性并可導(dǎo)致鵝胚死亡。由于GPV表面沒有囊膜結(jié)構(gòu)，所以乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑無法對病毒產(chǎn)生作用，并且GPV對胰酶也有抵抗力，但對紫外線較敏感［15］。大多數(shù)種類的細(xì)小病毒，如犬細(xì)小病毒（Canine Parvovirus Virus，CPV）、貓泛白細(xì)胞減少癥病毒（Feline Panleukopenia Virus，F(xiàn)PV）等具有血凝性，然而GPV卻無血凝性［16］。

2 鵝細(xì)小病毒分子結(jié)構(gòu)

GPV基因組由單鏈線狀DNA構(gòu)成，全長為5 kb左右，如圖1所示［17］，GPV基因包括2個(gè)開放性閱讀框，可合成5種基因，分別為VP1、VP2、VP3、NS1和NS2，其基因長度分別為2 199、1 764、1 605、1 884 nt和1 356 nt。病毒基因組5′及3′端還具有重復(fù)倒置的回文結(jié)構(gòu)（Inverted Terminal Repeat，ITR），其長度為444 nt，分為頭部和“泡區(qū)”。GPV的基因組可以編碼5種蛋白，分別為3種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3及2種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2，編碼蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分別為88、65、60 ku和77、50 ku左右［18-20］。Viginie［21］通過基因序列對比分析發(fā)現(xiàn)，鵝細(xì)小病毒與番鴨細(xì)小病毒同源性較高，這提示這兩種病毒有可能都是從腺聯(lián)病毒2型演化而來的。

圖1 GPV基因組結(jié)構(gòu)

2.1 結(jié)構(gòu)蛋白

GPV的LORF可以編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為VP1、VP2、VP3。這3種結(jié)構(gòu)蛋白的起始密碼子位點(diǎn)各不相同，但是共用相同終止密碼子［22］。GPV的VP基因中有一個(gè)P41啟動(dòng)子位于起始密碼子前，P41的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)剪接后翻譯產(chǎn)生VP1和VP2蛋白。在合成整個(gè)核殼后，GPV的VP2蛋白N端剪去部分氨基酸從而形成VP3［23］。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，GPV有3個(gè)閱讀框，其中VP1基因包括VP2基因，VP2基因又包括VP3基因。VP1和VP3基因的起始密碼子是ATG，但是VP2的起始密碼子是非典型的ACG。這些基因編碼的VP1蛋白比VP2蛋白N末端多145個(gè)氨基酸，比VP3蛋白N末端多198個(gè)氨基酸［24］。

根據(jù)對不同種類細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，VP1、VP2、VP3蛋白參與到病毒感染宿主細(xì)胞的過程。VP1蛋白在病毒衣殼蛋白的合成及形成感染性顆粒的過程中起著重要作用。VP1蛋白的N末端含有信號肽序列，可以引導(dǎo)病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的定位；其N末端還有一些磷脂酶序列，可能參與了病毒的感染。細(xì)小病毒侵入到宿主細(xì)胞后，病毒衣殼通過內(nèi)吞小體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，VP1蛋白由于低pH值等不良環(huán)境暴露出其獨(dú)特區(qū)，暴露出的N端就可指引內(nèi)吞小體往細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)［25］。如果病毒的VP1蛋白缺失，VP2蛋白也可以折疊組裝病毒顆粒，說明VP2參與病毒衣殼的合成以及病毒顆粒的細(xì)胞核輸出［26-27］。

構(gòu)成GPV衣殼蛋白的3種結(jié)構(gòu)蛋白均有抗原性，其中VP3蛋白占的比重最大，約為80%［28］。VP3蛋白為抗原決定簇的主要成分，構(gòu)成鵝細(xì)小病毒的保護(hù)性抗原［29-30］。研究發(fā)現(xiàn)，VP3以多肽的形式暴露于病毒表面，是GPV重要的免疫保護(hù)性抗原，可以誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體，在GPV的免疫防制及診斷中具有重要的意義［31］。

由于GPV是無囊膜病毒，其衣殼蛋白表面的凹痕或突起能夠識別受體［32］。糖脂、聚糖和糖蛋白可以作為受體幫助鵝細(xì)小病毒進(jìn)入宿主病毒［33］，這意味著衣殼蛋白的任何突變或改變都可能導(dǎo)致病毒無法侵入宿主細(xì)胞［34］。之前的研究表明，Adeno-associated Virus-2（AAV-2）的 VP蛋白上有5個(gè)氨基酸（Arg-484，Arg-487，Lys-532，Arg-585，Arg-588）是受體結(jié)合位點(diǎn)［35-36］。因?yàn)轾Z細(xì)小病毒和AAV-2同屬細(xì)小病毒，因此，在這些受體結(jié)合位點(diǎn)或周邊氨基酸的改變可能會(huì)改變鵝細(xì)小病毒的毒力［37］。其中在VP蛋白489位點(diǎn)氨基酸的改變可能會(huì)導(dǎo)致水禽細(xì)小病毒從鵝向鴨進(jìn)行擴(kuò)散［33］。

2.2 非結(jié)構(gòu)蛋白

非結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)小病毒中有著重要的作用。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白功能主要有：①參與細(xì)小病毒增殖［38］，即人腺病毒相關(guān)病毒2型（AAV-2）的NS78蛋白含有高度保守的基序GPTTGK，具有解旋酶活性和與NTP相結(jié)合的能力，GPV的NS1蛋白也可能具有這個(gè)功能［39］；②對宿主細(xì)胞具有毒性作用，即細(xì)小病毒的NS1蛋白可導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化乃至甚至發(fā)生程序性死亡［40］。

細(xì)小病毒的NS2蛋白在病毒復(fù)制過程中扮演著重要的角色，從而影響感染性病毒顆粒的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠細(xì)小病毒（Minute Virus of Mice，MVM）NS2蛋白可以與核輸出蛋白CRM1結(jié)合，從而使NS2蛋白出宿主細(xì)胞核進(jìn)而產(chǎn)生病毒顆粒，如果NS2基因發(fā)生變異就會(huì)影響病毒衣殼蛋白的合成，也會(huì)導(dǎo)致病毒不可復(fù)制或使病毒顆粒產(chǎn)生的時(shí)間延后［41］。研究發(fā)現(xiàn)，MVM的NS2蛋白的氨基末端為毒性作用的活性區(qū)域，可以輔助NS1蛋白對宿主細(xì)胞的毒性作用。

此外，已經(jīng)有研究證明GPV的非結(jié)構(gòu)蛋白具有抗原性。邢明偉［42］通過原核表達(dá)的方式將GPV H1分離株的NS2蛋白表達(dá)出來，經(jīng)Western-blot和Dot-ELISA鑒定，表達(dá)的NS2蛋白可與特異性抗體產(chǎn)生中和。

細(xì)小病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的復(fù)制和對宿主細(xì)胞毒性作用中有著重要的作用，但是GPV非結(jié)構(gòu)蛋白的作用與其他種類細(xì)小病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白是否具有相同或相似功能依然有待進(jìn)一步研究。

2.3 末端回文結(jié)構(gòu)（ITR）

細(xì)小病毒科中不同種類的病毒可以根據(jù)其ITR的特點(diǎn)分為A、B兩類：A類細(xì)小病毒，如腺關(guān)聯(lián)病毒2型（Adeno-associated Virus-2，AAV2）、人細(xì)小病毒B19（Human Parvovirus B19，B19）的基因組兩端的ITR的序列相同，是末端倒置重復(fù)序列；與之相對應(yīng)的是，B類細(xì)小病毒基因組兩端的ITR序列彼此不相關(guān)。GPV基因組兩端的ITR倒置重復(fù)序列相同，并且其形狀大小與B19相近，說明GPV屬于A類細(xì)小病毒［42］。GPV毒株基因組兩端的ITR基因長度約為444 nt，但是不同時(shí)間和不同地點(diǎn)分離的GPV的ITR長短各不相同。ITR基因組由于其特殊的分子排布，其頭部可以折疊形成U形雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)中包含160～180 nt的無錯(cuò)配“莖部”與44 nt的“泡區(qū)”，形成“箭狀”結(jié)構(gòu)。在“泡區(qū)”頭端有一個(gè)構(gòu)成對稱中心的SphⅠ內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)（GCATGC）。除此之外，還有數(shù)量眾多的4～10 nt短核苷酸重復(fù)序列存在于GPV的ITR基因序列中［39］。

目前，細(xì)小病毒基因組中ITR的功能依然并不是很清晰，但是研究認(rèn)為ITR在細(xì)小病毒的復(fù)制和組裝過程中發(fā)揮著作用，在細(xì)小病毒DNA復(fù)制過程中扮演著重要的角色。曹佐武［43］將AAV2基因組一端的ITR去除發(fā)現(xiàn)，AAV2缺失了一個(gè)ITR后，其感染能力和病毒包裝能力明顯降低，說明ITR在細(xì)小病毒AAV2的感染力和病毒包裝能力中發(fā)揮著重要的作用。

3 結(jié)語

目前，關(guān)于GPV的研究不夠深入，大多是針對GPV的序列分析及致病性研究，而針對GPV的序列分析大多局限于其LORF和RORF，對于強(qiáng)弱毒株的差異、受體結(jié)合位點(diǎn)、抗原位點(diǎn)、跨宿主位點(diǎn)等方面的研究不夠深入。尤其是隨著水禽養(yǎng)殖量的不斷增加，在保證了有效接種疫苗的情況下，依然有大量的GPV病例發(fā)生，這說明GPV毒力株和疫苗株可能已經(jīng)產(chǎn)生了分子生物學(xué)上的差異，而研究人員對這種差異的研究依然較少。GPV的ITR結(jié)構(gòu)被認(rèn)為可能和病毒毒力有關(guān)，低致病力毒株或疫苗株的ITR多較短，但I(xiàn)TR的具體功能還需要進(jìn)一步的科學(xué)驗(yàn)證。關(guān)于ITR功能的進(jìn)一步研究會(huì)為GPV基因工程疫苗的研制提供新的研究方向。

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