昆蟲體內(nèi)共生菌鑒定方法的研究進(jìn)展

向候君,蔡普默,季清娥,楊燕川,王 波,陳家驊

福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,福建 福州 350002

在昆蟲體內(nèi)通常存在多種微生物，如細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物等，它們能夠影響昆蟲的某些重要生命活動(dòng)過程[1,2]。研究昆蟲腸道微生物不僅利于開發(fā)利用昆蟲資源和害蟲防治，而且能從昆蟲腸道中獲得某些特殊功能的細(xì)菌資源[3]，應(yīng)用于植物病害的防治，控制動(dòng)物疫病的傳播等[4]。昆蟲內(nèi)微生物與宿主的相互關(guān)系已逐漸成為昆蟲學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，此外，各種生物學(xué)技術(shù)在昆蟲學(xué)、微生物學(xué)等領(lǐng)域的大量應(yīng)用，也極大推動(dòng)了昆蟲體內(nèi)微生物種類、多樣性、功能、與宿主互作及協(xié)同進(jìn)化關(guān)系的研究[1]。

由于微生物個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡單，分類鑒定除了采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生態(tài)學(xué)及生理學(xué)特征，還應(yīng)尋找新的特征作為其分類鑒定依據(jù)[5]。人們對昆蟲體內(nèi)微生物的鑒定，最初以傳統(tǒng)方法如生物分型、血清分型、抗微生物易感性試驗(yàn)、免疫印跡法、噬菌體分型和多位點(diǎn)酶電泳法等為主。這些方法統(tǒng)稱為表型分類法，是以菌體的表現(xiàn)類型為依據(jù)對細(xì)菌進(jìn)行分類和鑒定[6]。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的出現(xiàn)，建立了一種新的分類系統(tǒng)—遺傳型分類法，主要原理是對微生物的染色體DNA進(jìn)行直接分析或?qū)ζ淙旧w外DNA片段進(jìn)行分析，進(jìn)而從遺傳進(jìn)化角度去認(rèn)識細(xì)菌，從分子水平對它們進(jìn)行分類與鑒定[6]。目前，昆蟲內(nèi)共生菌的功能研究也進(jìn)入了一個(gè)新的階段。近幾年，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)以及新一代高通量測序工具和分析軟件等，以及基因組學(xué)工具的進(jìn)步及發(fā)展，促進(jìn)了宿主昆蟲共生機(jī)制及其內(nèi)共生菌研究的發(fā)展，為從微觀角度研究共生菌與宿主昆蟲種群形成、擴(kuò)散的共生機(jī)制提供了便利[7]。本文旨在對昆蟲內(nèi)共生菌鑒定的研究方法及其應(yīng)用研究進(jìn)行綜述，為研究昆蟲微生物的生物群落及功能機(jī)制等研究提供技術(shù)參考。

1 昆蟲體內(nèi)微生物的鑒定方法

1.1 傳統(tǒng)的鑒定方法

在分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展之前，對昆蟲微生物的鑒定，主要采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生理生化特性鑒定法，即宏觀菌落形態(tài)學(xué)觀察，以及生理生化實(shí)驗(yàn)如糖類、蛋白質(zhì)和氨基酸代謝試驗(yàn)、胺鹽和有機(jī)酸鹽利用試驗(yàn)、毒性酶類試驗(yàn)、呼吸酶類試驗(yàn)等對其進(jìn)行逐級鑒定[6]，之后再根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》等理論依據(jù)對得到的菌種進(jìn)行分類鑒定[6,8]。如孟祥杰等[9]通過平板法從六斑異瓢蟲Aiolocaria mirabilis的雌性成蟲腸道中分離到5株細(xì)菌，通過觀察菌落形態(tài)、細(xì)胞的生物學(xué)特征和生理生化特征等，分別鑒定為地桿菌屬Terrabacter、李斯特菌屬Listeria、纖維單胞菌屬Cellulomonas、短小桿菌屬Curtobacterium和皮桿菌屬Demabacter細(xì)菌。

微生物鑒定方法包括分子遺傳學(xué)鑒定法和表型鑒定法兩類，其中表型鑒定法是對細(xì)菌形態(tài)和生理生化水平、蛋白質(zhì)水平、細(xì)胞組分水平的鑒定，包括常規(guī)鑒定法、數(shù)值分類鑒定法和化學(xué)分類鑒定法[10,11]。為了改革和優(yōu)化傳統(tǒng)的鑒定技術(shù)，一些簡便、快速、自動(dòng)化的鑒定技術(shù)迅速發(fā)展起來，不但普及了鑒定技術(shù)，而且還大大提高了工作效率。具有代表性的如應(yīng)用于各種細(xì)菌鑒定的“API”系統(tǒng)、“Biolog”系統(tǒng)[11]。

API鑒定系統(tǒng)：該系統(tǒng)包括15種鑒定條，可鑒定包括腸桿菌(API20E、API 10S、RapiD 20E)、革蘭陰性桿菌(API 20NE)、厭氧菌(API 20A)、彎曲菌(API Campy)、棒狀桿菌(API Coryne)、李斯特菌(API Listeria)、奈瑟氏-嗜血桿菌(APINH)、葡萄球菌(API Staph)、鏈球菌(API 20Strep)、酵母菌(API 20CAUX、API Candida)、乳桿菌和芽胞桿菌(API 50CH)等600種以上的細(xì)菌[12]。從橘小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis3個(gè)種群(實(shí)驗(yàn)室正常喂養(yǎng)種群、實(shí)驗(yàn)室無菌糖水喂養(yǎng)種群、野生種群)成蟲腸道中分離培養(yǎng)的600株細(xì)菌中得到53種不同細(xì)菌遺傳型，在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)，然后對其菌落特征進(jìn)行觀察，主要分別從細(xì)菌形狀、菌落形態(tài)、顏色、透明度、革蘭氏染色、芽孢有無等方面進(jìn)行區(qū)別鑒定[13]，之后采用法國梅里埃公司生產(chǎn)并由上海長源科學(xué)技術(shù)有限公司代理銷售的ID32E腸桿菌科和其它革蘭氏陰性桿菌鑒定系統(tǒng)及API 50CHB芽孢桿菌屬鑒定系統(tǒng)對其成蟲腸道可培養(yǎng)微生物進(jìn)行鑒定，最終分屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)和芽孢桿菌科(Bacillaceae)等3個(gè)科。其中腸桿菌科是腸道可培養(yǎng)細(xì)菌中最優(yōu)勢的細(xì)菌種類[13,14]。

Biolog微生物鑒定系統(tǒng)由濁讀儀、讀數(shù)儀、軟件、數(shù)據(jù)庫、微孔鑒定板組成，與計(jì)算機(jī)聯(lián)網(wǎng)。對結(jié)果的鑒定需要考慮可能性(Probability)、相似性(Similarity)、位距(Distance)這3個(gè)參數(shù)；通過相似性(SIM)，位距(DIST)和可能性(PROB)值與數(shù)據(jù)庫中的ID比較，確定被鑒定的微生物的屬種。Biolog微生物鑒定系統(tǒng)的基本步驟：BUY培養(yǎng)基的配制；接種培養(yǎng)；平板劃線；濁度調(diào)整；接種鑒定板；讀取數(shù)據(jù)；結(jié)論與數(shù)據(jù)分析[5]。利用Biolog-Eco方法，對以抗蟲轉(zhuǎn)cry1Ab基因粳稻(KMD1/KMD2)及其對照(秀水11)為食的褐飛虱腸道微生物群落多樣性進(jìn)行比較研究，以評價(jià)其對該飛虱腸道微生物多樣性的影響。室內(nèi)和田間的研究結(jié)果均表明，以KMD1為食時(shí)，其微生物群落的平均顏色變化率（AWCD）明顯高于以KMD2和對照為食[15]。

1.2 分子生物學(xué)方法

依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)手段，且由于人們的認(rèn)知條件限制，許多微生物尚難以被分離培養(yǎng)，因此對于揭示昆蟲微生物區(qū)系的多樣性有很大的局限性[4,6,16,17]。通過分子生物學(xué)方法研究的結(jié)果表明，人們只分離出了自然界0.1%～1.0%的微生物，99%以上的環(huán)境微生物是無法獲得純培養(yǎng)的[4,18,19,20]，因此以純培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)對微生物進(jìn)行的研究結(jié)果并不能完全代表其真實(shí)的情況。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于核酸序列分析的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用到昆蟲微生物學(xué)研究中，即包括基于核酸水平的鑒定，對細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA進(jìn)行分析的分子遺傳學(xué)鑒定法[10,21]。目前，研究昆蟲微生物多樣性的分子生物學(xué)方法主要包括：變性梯度凝膠電泳（DGGE）、16S rRNA基因技術(shù)、分子雜交技術(shù)、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、擴(kuò)增性核糖體DNA限制性酶切片段分析（ARDRA）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（RT-qPCR）以及細(xì)菌宏基因組測序技術(shù)等，為不可培養(yǎng)微生物的菌群結(jié)構(gòu)分析提供了有力的手段[22,23]。

1.2.1 變性梯度凝膠電泳（DGGE） 該技術(shù)是利用尿素和甲酞胺兩種變性物質(zhì)制成一種由低至高濃度的變性膠，雙鏈DNA在變性物質(zhì)的作用下變性，不同堿基組成的DNA雙螺旋在電泳時(shí)會在不同的變性劑濃度中發(fā)生變性，導(dǎo)致其電泳遷移速率降低，于是DNA分子停留在凝膠中不同的位置，得以分離[5,13,27]。主要步驟：先提取樣品總DNA，對16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行PCR-DGGE凝膠電泳，相同長度的不同的核酸序列經(jīng)電泳后在聚丙稀酰胺膠上分離開來?？筛鶕?jù)條帶的位置和亮度估算原始樣品中DNA的相對含量，或者通過割膠獲取目的DNA條帶，然后對DNA進(jìn)行PCR回收后連接到T載體上，篩選陽性克隆子后再通過測序進(jìn)行分析，從而推斷出微生物的群落結(jié)構(gòu)及相應(yīng)的優(yōu)勢菌群[24]。王甸洪等[25]運(yùn)用PCR-DGGE和16S rRNA文庫相結(jié)合的方法研究了螺旋粉虱Aleurodicus dispersus體內(nèi)細(xì)菌多樣性和主要優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)。通過PCR-DGGE技術(shù)，在小菜蛾腸道中分離到15個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌的16S rRNA序列，通過序列比對結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析，這些細(xì)菌序列屬于3個(gè)門6個(gè)屬以及3種環(huán)境中不明確樣本（Uncultured bacteria）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，變形菌門的沙雷氏菌（Serratia）在幼蟲腸道中分布最廣泛，Pseudomonas和Serratia在腸道細(xì)菌數(shù)量上占優(yōu)勢地位[16]。同樣通過這種方法對桑粒肩天牛Apriona germari不同采集時(shí)間的樣品進(jìn)行研究，結(jié)果表明腸道菌種類差異很大[26]。

1.2.2 16S rRNA基因技術(shù) 該技術(shù)是通過將獲得的微生物16S rRNA基因的序列信息與已知菌種的16S rRNA序列進(jìn)行比對，從而對未知微生物進(jìn)行分類和鑒定。主要有三個(gè)步驟：首先是獲得基因組DNA，接著是擴(kuò)增16S rRNA基因片段，最后就是測序分析16S rRNA基因序列[27]。在對褐飛虱Nilaparvata lugens體外培養(yǎng)細(xì)菌類內(nèi)共生菌的研究中，用普通培養(yǎng)基分離純化后的菌株用菌類16S rDNA的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)其與粉虱科的殺雄菌屬內(nèi)共生菌（Arsenophonussp.）相似度達(dá)99%[28]。有研究采用16S rDNA基因文庫技術(shù)和Illumina HiSeq測序技術(shù)檢測了自然種群澤蘭實(shí)蠅Procecidochares utilis幼蟲腸道內(nèi)的細(xì)菌群落及多樣性?？偣沧⑨尩?3個(gè)門，4個(gè)綱，6個(gè)目，7個(gè)科，10個(gè)屬和4個(gè)種。其中變形菌門(Proteobacteria)的細(xì)菌為優(yōu)勢菌，占99%；在屬分類階元上，沃爾巴克氏體屬（Wolbachia）占45%，是優(yōu)勢屬[29]。分離于小菜蛾腸道的80株可培養(yǎng)細(xì)菌的16S rDNA基因片段經(jīng)測序，可初步確定細(xì)菌主要分布在腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，假單胞菌科(Pseudomonadaceae)，鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)，黃色單胞菌科(Xanthomonadaceae)和黃桿菌科(Flavobacteriaceae)等五個(gè)科。所占比例達(dá)到76.25%，是腸道可培養(yǎng)微生物最優(yōu)勢菌群[30]。

1.2.3 分子雜交技術(shù) 該技術(shù)是利用待檢測樣品的16S rRNA基因和特定已知序列分子探針進(jìn)行雜交，以確定樣品中微生物群落組成及豐度。主要方法包括：芯片雜交、熒光原位雜交以及原位雜交等[22]。其基本的操作步驟：先對序列進(jìn)行排隊(duì)，序列特異性鑒定，然后互補(bǔ)核酸探針的合成和標(biāo)記，最后進(jìn)行探針特異性和測定敏感性評價(jià)和優(yōu)化[31]。采用基因芯片技術(shù)研究人類致病菌瘧原蟲Plasmodium falciparum攜帶者岡比亞按蚊Anopheles gambiae的腸道菌區(qū)系組成及腸道細(xì)菌與瘧原蟲P.falciparum之間的關(guān)系，結(jié)果表明腸道微生物能夠通過調(diào)節(jié)A.gambiae的某些免疫基因?qū)汞懺x的感染[32]。采用熒光原位雜交技術(shù)，研究臭椿Parastnachia japonensi腸道共生菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)P.japonensis體內(nèi)存在一種?-變形菌綱細(xì)菌的專性共生菌，并且P.japonensis中腸后端有一個(gè)特化的結(jié)構(gòu)，共生菌專性棲居在該共生體器官內(nèi)[33]。

1.2.4 限制性片段長度多態(tài)性（RFLP） 該技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶能識別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開DNA分子，即產(chǎn)生限制性片段的特性，不同種群的生物個(gè)體DNA序列存在差別，因此可檢測DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。基本步驟：首先擴(kuò)增一基因或基因片段，然后用限制性內(nèi)切酶酶切該擴(kuò)增片段,最后通過電泳酶切片段以區(qū)分[24,34]。通過該技術(shù)已經(jīng)對昆蟲腸道(包括金龜子腸道、白蟻腸道等)等生境中的微生物群落組成和多樣性進(jìn)行了一定的研究[35,36]。用該方法對桑粒肩天牛腸道微生物的16S rDNA擴(kuò)增片段分析建立的傳統(tǒng)克隆文庫，根據(jù)不同的酶切指紋圖譜將175個(gè)克隆子歸為48個(gè)不同的分類操作單元(OTUs)。通過各選一個(gè)分類操作單元，作為一個(gè)代表克隆子進(jìn)行測序比對，可知這48個(gè)OTUs分屬于22個(gè)不同的細(xì)菌屬，其中優(yōu)勢菌分屬于腸球菌屬(Entorococcus)，乳球菌屬(Lactococcus)和克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，分別占所檢測克隆總數(shù)的17.1%，19.4%和24.6%[26]。利用細(xì)菌的16S rRNA-RFLP方法分析柏大蚜Cinara tujafilina和松大蚜C.pinitabulaeformis的結(jié)果表明：其體內(nèi)細(xì)菌組成主要是初級內(nèi)共生菌Buchnera aphidicola和次級內(nèi)共生菌Candidatus Serratia symbiotica，并且分別所占的比例也有差異。在柏大蚜中，B.aphidicola占37%，C.Serratia symbiotica占56%，還有少量的腸桿菌屬Enterobacter占7%；在松大蚜中，B.aphidicola占66.7%，C.Serratia symbiotica占33.3%[23]。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（RT-qPCR） 該技術(shù)是根據(jù)樣本核酸擴(kuò)增呈指數(shù)增長，在反應(yīng)體系和條件完全一致的情況下，樣本DNA含量與擴(kuò)增產(chǎn)物的對數(shù)成正比，且反應(yīng)體系中的熒光染料或熒光標(biāo)記物(熒光探針)與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光，其熒光量與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，通過熒光量的檢測來測定樣本核酸量[40]。主要步驟是將熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)放到PCR反應(yīng)體系中，利用熒光信號的變化來實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR的進(jìn)程，然后通過其繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析[27,38,39]。楊義婷[40]運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)方法，檢測不同發(fā)育歷期的煙粉虱Bemisia tabaci體內(nèi)的R.bellii菌的拷貝數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)在煙粉虱發(fā)育過程中，R.bellii菌的拷貝數(shù)會在羽化初期發(fā)生顯著性增長，隨后下降，但第六天又開始發(fā)生顯著上升趨勢，從而明確了優(yōu)勢種菌在煙粉虱發(fā)育歷期、產(chǎn)卵量、存活率、抱卵量和后代性比等方面的影響。此技術(shù)也應(yīng)用于昆蟲檢疫及昆蟲的分類鑒定等方面的研究，例如B型煙粉虱的鑒定[41]。

1.2.6 擴(kuò)增性核糖體DNA限制性酶切片段分析(ARDRA)該技術(shù)主要作用于核糖體DNA序列，不同物種rDNA序列不盡相同，使用相同限制性內(nèi)切酶對其進(jìn)行酶切，則會產(chǎn)生不同數(shù)量、不同長度的片段，從而將不同微生物區(qū)別開來[22]。基本步驟：采用特異限制性內(nèi)切酶對一定長度的DNA片段進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離和檢測，從而分析微生物的多樣性[42]。采用ARDRA技術(shù)研究暗黑鰓金龜Holotrichia parallela幼蟲腸道內(nèi)可培養(yǎng)纖維素分解菌的多樣性，結(jié)果可將分離得到的207株菌株歸為21種不同的類型[43]。從思茅松毛蟲Dendrolimu kikuchii4齡幼蟲腸道環(huán)境中分離、純化、培養(yǎng)，可獲得11株好氧細(xì)菌的菌株，以細(xì)菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行ARDRA多態(tài)性分析，在84%的相似水平上可分成6大類群，多樣性豐富[44]。

1.2.7 宏基因組測序技術(shù) 該技術(shù)是對于一些不可以培養(yǎng)微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究的新技術(shù)[40,45]?；静襟E是通過高通量測序與分析，對微生物種群的DNA片段進(jìn)行拼接重組，并與公布數(shù)據(jù)庫中其他菌類的信息比對，即可預(yù)測該菌種可能存在的功能[40]。運(yùn)用宏基因組測序技術(shù)對不同生物型的豌豆蚜進(jìn)行研究，鑒定出了21種共生菌，其中8種占主導(dǎo)地位，共生菌之間的復(fù)雜聯(lián)系是導(dǎo)致寄主植物專化性的重要因素[46]。夏曉峰[47]測定了小菜蛾幼蟲、蛹和成蟲的中腸微生物宏基因組，宏基因組分析表明小菜蛾中腸微生物由變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、藍(lán)細(xì)菌門Cyanobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、放線菌門Actinobacteria、硝化螺旋菌門Nitrospirae，以及古細(xì)菌的廣古菌門Euryarchaeota,真菌的擔(dān)子菌門Basidiomycota和子囊菌Ascomycota組成，占整個(gè)中腸微生物的99%以上。

2 昆蟲體內(nèi)共生菌的研究方法在研究宿主的生理功能中的應(yīng)用

昆蟲內(nèi)共生菌是昆蟲與微生物在長期進(jìn)化過程中形成的蟲菌共生體系中的重要部分，對宿主的生長與發(fā)育起著非常重要的作用。昆蟲體內(nèi)組織為內(nèi)共生菌的生存繁殖提供了理想的物質(zhì)及環(huán)境條件，昆蟲內(nèi)共生菌主要具有調(diào)節(jié)生殖生長發(fā)育、營養(yǎng)平衡和抵御病原侵害等作用[4,48]。

2.1 共生菌種群變化與抗藥性的關(guān)系

采用PCR-DGGE的分子生物學(xué)的技術(shù)對敏感的品系、抗高效的氯氰菊酯品系的德國小鐮Blattella germanica的腸道菌進(jìn)行分析，通過敏感與抗性品系的德國小鐮腸道的圖譜差異，電泳條帶的數(shù)量和遷移率的不同，得知在外界殺蟲劑的作用下能夠顯著的改變德國小鐮的體內(nèi)微生物的種類及種群數(shù)量。并且在去除腸道菌后的德國小鐮幼蟲的孵化數(shù)、幼蟲的羽化率均會降低，所產(chǎn)后代的雌性個(gè)體比例下降，繁殖力與敏感品系相比呈下降的趨勢，表現(xiàn)出繁殖不利性。腸道菌除了影響德國小鐮的生殖方面，對其生長和發(fā)育也有顯著的影響，去除腸道菌的德國小鐮的幼蟲死亡率較高，且從幼蟲到成蟲期間的生長的歷期會有所延長[49]。

2.2 共生菌與昆蟲免疫系統(tǒng)的互作研究

在昆蟲共生細(xì)菌與病毒的關(guān)系上，有研究表明，在黑腹果蠅中Wolbachia能夠提高宿主對許多病毒的抵抗能力，并且在其他昆蟲中Wolbachia可能也具有類似功能[50]。利用攜帶共生菌的線蟲侵染、鎢針沾共生菌菌懸液針刺和人工飼喂共生菌這3種方法將S.nematodiphilaR187植入黑腹果蠅Drosophila melanogaster血腔或腸道；通過果蠅死亡率、細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)，結(jié)合果蠅體液免疫信號系統(tǒng)調(diào)控的2種抗菌肽—Diptericin和Drosomycin表達(dá)的qPCR檢測，發(fā)現(xiàn)H.rugaoensis攜帶共生菌和共生菌針刺侵染后同時(shí)激活果蠅的Toll和Imd途徑；熒光定量PCR結(jié)果顯示侵染過程中Diptericin和Drosomycin的相對表達(dá)均呈先上升再逐漸減弱的趨勢；結(jié)果證明S.nematodiphilaR187侵染果蠅時(shí)，Toll途徑和Imd途徑都被激活；果蠅抵抗S.nematodiphilaR187入侵的體液免疫信號通路主要是其Imd途徑；S.nematodiphilaR187可能采用免疫逃避機(jī)制從其腸道成功侵染果蠅[51]。

2.3 共生菌與昆蟲營養(yǎng)代謝的相互關(guān)系

有研究應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對華山松大小蠢Dendroctonus armandi的微生態(tài)組成、不同發(fā)育階段和雌雄成蟲間真菌群落多樣性動(dòng)態(tài)進(jìn)行研究，揭示了華山松大小蠢腸道真菌群落多樣性差異，并且發(fā)現(xiàn)真菌群落組成中的酵母菌(假絲酵母Candida)和絲狀真菌(藍(lán)變真菌Ophiostoma）可能直接或間接幫助華山松大小蠢克服寄主樹木抗性，并為其發(fā)育提供必要的營養(yǎng)和能量補(bǔ)充[20]。張來麗等[52]研究發(fā)現(xiàn)白蟻腸道微生物對降解木質(zhì)素起著主導(dǎo)作用，木質(zhì)素的完全降解是真菌，細(xì)菌及相應(yīng)微生物群落共同作用的結(jié)果。

2.4 共生菌種群對昆蟲生長發(fā)育和壽命的影響

利用16S rDNA-454焦磷酸測序技術(shù)調(diào)查了水虻各個(gè)連續(xù)生命階段的細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)擬桿菌門和變形菌門最具優(yōu)勢的菌門；經(jīng)過產(chǎn)卵地點(diǎn)選擇測試（OSP）后，確定起關(guān)鍵作用的是一個(gè)細(xì)菌復(fù)合體（BSF-4），其中有4株菌，對水虻產(chǎn)卵都具有吸引作用；通過對蟲卵進(jìn)行處理獲得無菌幼蟲，之后測定在喂食相同無菌人工飼料條件下無菌幼蟲與正常幼蟲生活史特性的差異。結(jié)果顯示，無菌幼蟲預(yù)蛹率和存活到成蟲階段的比率均顯著低于正常幼蟲[53]。采用PCR-DEEG和超級PCR等技術(shù)對地中海實(shí)蠅（Ceratitis capitata）腸道菌群的研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)室條件下接種高水平綠膿桿菌會減少地中海實(shí)蠅壽命，而接種腸桿菌科卻能增加地中海實(shí)蠅壽命[54]。

3 結(jié)語與展望

研究表明，內(nèi)共生菌可為宿主提供食物中缺乏的必需營養(yǎng)物質(zhì)，并協(xié)助消化食物和解毒[7,55,56,57]，許多微生物含有多種酶系統(tǒng)，可通過協(xié)助宿主的營養(yǎng)代謝，提供食物中缺乏的營養(yǎng)物質(zhì)，并彌補(bǔ)食物中營養(yǎng)物質(zhì)的不足；以及分泌抗菌肽、毒素等物質(zhì)來增強(qiáng)宿主昆蟲自身防御病原微生物和寄生物的能力[58,59,60,61]。同時(shí)，也可以調(diào)控植物生理反應(yīng)，增強(qiáng)宿主的抗逆性，抑制植物對宿主的不利影響，也可以通過對抗逆性基因的精確表達(dá)調(diào)控來增強(qiáng)宿主抗藥性等[7,45]。昆蟲的生理活動(dòng)與體內(nèi)共生微生物或腸道微生物之間有著密切的聯(lián)系，在探索昆蟲微生物及共生微生物的功能研究中，分析微生物的生物群落及多樣性必不可少，選擇合適的分析昆蟲微生物群落的方法就尤為重要。

本部分將對文中提到的各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行比較（附表1），并對各方法的適用條件進(jìn)行概述。對于傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)無法培養(yǎng)和檢出的細(xì)菌，可以利用基于16S rRNA序列的分子生物技術(shù)。16S rRNA基因分析技術(shù)是微生物多樣性究中最先使用的方法之一，在微生物的分類鑒定研究中發(fā)揮了重要的作用[22]。原核生物中的16S rRNA序列具有高度的保守性，在分子生物的角度看來，適用于分析屬及屬以上水平的菌株[27]。PCR-DGGE技術(shù)是根據(jù)PCR產(chǎn)物序列的特異性的熔解溫度來進(jìn)行分離的，只要條件合適且操作精確，可以檢測出具有一個(gè)核苷酸差異的DNA分子[13]。DGGE已廣泛用于分析自然環(huán)境中細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性。該方法可以同一時(shí)間檢測多個(gè)樣品以及區(qū)別群落中的處于優(yōu)勢的種類，對于了解種群時(shí)空變化是較好的方法，另外也可用來分析鑒定群落組成[27]。基于16S rRNA基因的DGGE技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于分析昆蟲腸道微生物多樣性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以其具備定量精準(zhǔn)、簡易高效、特異靈敏等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究的重要工具，目前已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究、食品檢測、環(huán)境檢測、醫(yī)學(xué)檢測與診斷等研究之中[39,62]。分子雜交技術(shù)廣泛應(yīng)用于微生物群落組成研究中，有人曾采用16S rRNA基因探針芯片對水、土壤以及氣溶膠樣品中的微生物組成進(jìn)行了研究，檢測出的微生物種類明顯多于傳統(tǒng)的研究方法檢測到的微生物種類[63]。利用PCR-RFLP分析細(xì)菌16S rRNA基因，一般可將其鑒定到種及亞種的水平[34]。ARDRA技術(shù)主要作用于核糖體DNA序列，能較好反映種間多樣性，適合種級水平區(qū)分，己被廣泛地用于環(huán)境微生物多樣性、生物群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究[42,64]。近年來，不斷發(fā)展起來的宏基因組測序技術(shù)，能夠解決實(shí)際工作中的許多問題。宏基因組是指某一生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和，主要指細(xì)菌和真菌的基因組總和[48]。復(fù)雜生境中的可培養(yǎng)及不可培養(yǎng)微生物種類及基因信息都可通過該技術(shù)被了解[22]。分子生物學(xué)技術(shù)能夠更客觀的反應(yīng)微生物的種類，也更適合于對生殖道微生物種類和腸道微生物群落等復(fù)雜系統(tǒng)的種群結(jié)構(gòu)及多樣性的分析[6]。當(dāng)然也可通過結(jié)合多種方法進(jìn)行比較研究，從而更準(zhǔn)確地反映昆蟲微生物的多樣性[8,65]。目前常采用傳統(tǒng)培養(yǎng)與分子生物學(xué)方法相結(jié)合的研究方式，來提高研究結(jié)果的可靠性。

由于測序技術(shù)的快速發(fā)展，現(xiàn)在的研究方法比較傾向于采用基因組測序，這樣能夠大大降低傳統(tǒng)培養(yǎng)和相關(guān)分子技術(shù)本身的一些缺陷，從而能更真實(shí)的反應(yīng)昆蟲和環(huán)境微生物的種類與數(shù)量[24]。在實(shí)際工作中，可根據(jù)檢測的材料、檢測的目標(biāo)和所擁有的基礎(chǔ)條件設(shè)施來選擇使用合適的研究方法。目前，利用宏基因組技術(shù)對昆蟲共生菌功能的研究報(bào)道還較少，因此，今后的研究方向可嘗試用宏基因組技術(shù)來分析昆蟲共生微生物的功能，完善昆蟲微生物的研究技術(shù)，為解釋昆蟲微生物與宿主營養(yǎng)代謝、免疫防御、抗藥性、生長發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)等方面的互作關(guān)系提供新思路。

附表1利用各分子生物學(xué)方法進(jìn)行微生物鑒定的優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 The advantages and disadvantages of various molecular biology methods to identify the microorganisms