缺氧誘導(dǎo)因子-1α、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平與糖尿病大鼠血糖血脂的相關(guān)性

符 杰 馮 俊 張 雨 廖麗婭 胡嫚麗 鄧紅艷

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市普愛醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 武漢 430033)

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病發(fā)病基礎(chǔ)上的高負(fù)荷血糖對(duì)于動(dòng)脈血管內(nèi)皮的長(zhǎng)期損傷，視網(wǎng)膜動(dòng)脈的長(zhǎng)期過(guò)氧化損傷可以促進(jìn)局部出血、鈣化及黃斑水腫等的形成，進(jìn)而導(dǎo)致視力的減退和最終致盲，臨床預(yù)后較差。糖尿病視網(wǎng)膜病變基礎(chǔ)病因的探討中發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)具有重要作用，長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致的視網(wǎng)膜損害刺激新生血管生長(zhǎng)，新生血管生長(zhǎng)可引起視網(wǎng)膜纖維增生，超過(guò)15%的患者還可發(fā)生視網(wǎng)膜脫離，進(jìn)而導(dǎo)致急性視力減退〔1，2〕。相關(guān)研究也證實(shí)，早期通過(guò)抑制VEGF能夠有效降低疾病的進(jìn)展率，并能夠在病理水平改善出血斑點(diǎn)、硬性滲出等〔3，4〕。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Glut)-1能夠誘導(dǎo)缺氧狀態(tài)，并改變局部視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的代謝環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)VEGF上調(diào)，促進(jìn)視網(wǎng)膜病變發(fā)展〔5，6〕。本研究探討 HIF-1α、Glut-1和VEGF與糖尿病大鼠血糖血脂的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1分組 雄性SD大鼠30只，體重190～210 g，平均體重(193.2±2.3)g，精心飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組20只和對(duì)照組10只。大鼠均在相同條件下飼養(yǎng)，購(gòu)自江蘇省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司，HIF-1α、Glut-1一抗體(兔來(lái)源，均購(gòu)自羅氏檢測(cè)公司)，VEGF抗體(羊來(lái)源，購(gòu)自美國(guó)Abcum公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海精密儀器有限公司，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗購(gòu)自南京碧云天生物科技有限公司。

1.3糖尿病大鼠建模 實(shí)驗(yàn)組于實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，腹腔注射4%水合氯醛280 μl/kg麻醉，固定在動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，腹腔注射50 mg/kg STZ。所有大鼠單籠喂養(yǎng)，定量飲水與普通喂食飼養(yǎng)2 w。血糖水平>11.1 mol/L，體重明顯降低，提示糖尿病大鼠制備成功。

1.4免疫組化染色法檢測(cè)視網(wǎng)膜HIF-1α、Glut-1和VEGF的表達(dá) 10 g/L戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射，采用0.5 mol/L的多聚甲醛灌流固定，石蠟切片，多聚賴氨酸處理。將切片置于60℃恒溫箱烘烤1 h，用二甲苯連續(xù)兩次浸泡10 min，水化后修復(fù)抗原，3%H2O2-甲醇溶液處理15 min，加HIF-1α、Glut-1和VEGF鼠單抗100 μl，37℃孵育1.0 h，加增強(qiáng)劑50 μl，室溫孵育20 min，加HRP標(biāo)記二抗50 μl，室溫孵育30 min，DAB顯色，鏡下觀察。

1.5觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 對(duì)比兩組視網(wǎng)膜組織細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果，判定標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞內(nèi)棕色或棕黃色顆粒則為蛋白陽(yáng)性反應(yīng)，HIF-1α蛋白主要在胞質(zhì)和胞核表達(dá)，VEGF和Glut-1蛋白主要在胞質(zhì)表達(dá)。染色強(qiáng)度+陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分，包括陰性：0分；弱陽(yáng)性：1分；中度：2分；強(qiáng)陽(yáng)性：3分。陽(yáng)性細(xì)胞率分級(jí)包括0分：≤5%；1分：6%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：>75%。染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分≥1分，判定為蛋白陽(yáng)性表達(dá)。檢測(cè)兩組三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、肌酐(Cr)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血紅蛋白(Hb)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、空腹血糖(FPG)、空腹血胰島素(FINS)、穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估法測(cè)定胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。門靜脈采血5 ml 3 000 r/min離心15 min，取上清液冷凍保存待測(cè)，將血清置于Eppendorf 管中，-80℃超低溫冰箱保存，采用全自動(dòng)生化儀成批檢測(cè)血糖和血脂水平。試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組視網(wǎng)膜HIF-1α、Glut-1和VEGF表達(dá) 兩組視網(wǎng)膜組織內(nèi)均有HIF-1α、Glut-1和VEGF的表達(dá)，見圖1。實(shí)驗(yàn)組HIF-1α、Glut-1和VEGF的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，見表1。

圖1 兩組HIF-1α、Glut-1和VEGF蛋白在視網(wǎng)膜組織中表達(dá)(DAB,×400)

組別nHIF-1α (pg/ml)Glut-1(pg/ml)VEGF(pg/ml)實(shí)驗(yàn)組20752.4±368.0479.4±221.349.3±15.9對(duì)照組10594.0±177.9268.8±120.727.0±14.1t值9.8579.74210.202P值0.007 50.008 20.004 8

2.2兩組血清相關(guān)指標(biāo)比較 兩組TG、TC、LDL-C、HDL-C、FBG、FINS、HbA1c和HOMA-IR檢測(cè)值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3HIF-1α、Glut-1和VEGF與糖尿病大鼠血糖血脂的相關(guān)性 糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)HIF-1α、Glut-1與血脂血糖指標(biāo)呈正相關(guān)(除與HDL-C呈負(fù)相關(guān))(均P<0.05)，VEGF與血脂和血糖(除HbA1c、FINS外)呈正相關(guān)(P<0.05)，與HDL-C呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表2 兩組血糖和血脂指標(biāo)對(duì)比

表3 HIF-1α、Glut-1和VEGF與糖尿病大鼠血糖血脂的相關(guān)性

3 討 論

視網(wǎng)膜病變是具有特異性改變的眼底病變，為糖尿病性微血管病變中最集中的體現(xiàn)。主要病理改變?yōu)閯?dòng)脈瘤、出血斑點(diǎn)、硬性滲出、棉絨斑、靜脈串珠狀及繼發(fā)性視網(wǎng)膜剝脫等。在糖尿病導(dǎo)致的局部動(dòng)脈血管的高血糖環(huán)境中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激及三磷酸腺苷(ATP)能量利用障礙更為明顯，局部視網(wǎng)膜基底膜長(zhǎng)期處于缺氧狀態(tài)，在白細(xì)胞介素(IL)-6及IL-8等炎癥因子的誘導(dǎo)下可反饋性促進(jìn)VEGF的生成〔7，8〕，擾亂內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞缺血缺氧，導(dǎo)致視網(wǎng)膜發(fā)生水腫、滲出及增生等病理改變。新生毛細(xì)血管的供血功能明顯減弱，同時(shí)新生血管分布較亂，常常侵犯玻璃體，導(dǎo)致局部滲漏和玻璃體剝離出血。 朱麗等〔9，10〕實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在抑制VEGF的基礎(chǔ)上，重度視網(wǎng)膜病變的發(fā)生率可下降15%左右，且疾病進(jìn)展率可下降20%，具有明顯的效果，這些均提示了VEGF在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)展中的作用。HIF-1α具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，在缺氧適應(yīng)、炎癥發(fā)展等方面發(fā)揮了重要作用，其可以通過(guò)刺激末端缺氧信號(hào)的活性調(diào)控區(qū)域(富含脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸)，進(jìn)而促進(jìn)局部細(xì)胞代謝的低氧和應(yīng)激基礎(chǔ)〔11，12〕；Glut-1可以介導(dǎo)葡萄糖的易化擴(kuò)散進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入血-視網(wǎng)膜屏障內(nèi)皮細(xì)胞，相關(guān)研究證實(shí)隨著視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展，Glut-1表達(dá)也明顯增加，特別是高表達(dá)的Glut-1可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞中的葡萄糖濃度增加，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜破壞〔13〕。

TG、TC和LDL-C等血脂指標(biāo)是糖尿病發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，本研究表明糖尿病大鼠體內(nèi)存在明顯的血脂代謝紊亂，長(zhǎng)期的血脂紊亂可以進(jìn)一步促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展，增加視網(wǎng)膜病變基礎(chǔ)上的視盤新生血管、視網(wǎng)膜前出血及牽拉性視網(wǎng)膜脫離等的發(fā)生率。VEGF上調(diào)可以促進(jìn)新生血管的形成及局部視網(wǎng)膜基底層的纖維化，視網(wǎng)膜間質(zhì)成分代償性增生，同時(shí)VEGF可進(jìn)一步促進(jìn)新生血管對(duì)于玻璃體的侵襲，進(jìn)一步導(dǎo)致玻璃體出血和增殖性視網(wǎng)膜病變的發(fā)生。而HIF-1α和Glut-1上調(diào)可能在這一過(guò)程中起到了重要促進(jìn)作用，Glut-1上調(diào)導(dǎo)致的經(jīng)過(guò)血-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的葡萄糖濃度明顯增加，而機(jī)體又缺乏有效的代償機(jī)制，從而促進(jìn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮的損傷。Ulas等〔14，15〕認(rèn)為，HIF-1α和Glut-1可以通過(guò)影響局部能量代謝、增強(qiáng)局部缺氧環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)VEGF上調(diào)，并通過(guò)糖尿病大鼠造模實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HIF-1α和Glut-1水平平均上升15%和25%，這與本次研究結(jié)論較為相似。