阿托伐他汀對(duì)1型糖尿病大鼠腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

胡瓊丹 胡柯琴 樊均明

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川 瀘州 646000)

糖尿病的高血糖狀態(tài)能夠誘發(fā)腎組織血管產(chǎn)生炎癥病變，同時(shí)伴有顯著的血管內(nèi)皮細(xì)胞改變，包括腎內(nèi)血管通透性增加、小球基底膜增厚等〔1～4〕。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β/Smad與1型糖尿病患者體內(nèi)腎臟纖維化、腎臟的病理?yè)p傷密切相關(guān)〔5〕。齊淑芳等〔6〕證明了山楂葉總黃酮能夠通過(guò)TGF-β/Smad通路抑制1型糖尿病大鼠腎臟纖維化，減輕糖尿病腎臟所受的損害。羥甲基戊二酰輔酶(HMG-Co)A還原酶抑制劑能夠降低腎內(nèi)炎癥性因子水平，從而抑制腎內(nèi)炎癥反應(yīng)，保護(hù)腎血管內(nèi)皮細(xì)胞〔7〕。本研究旨在探討阿托伐他汀(ATO)對(duì)糖尿病大鼠腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組 40只健康雄性成年SD大鼠，購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK(滬)2013-0018，體重260～300 g，平均(281.82±11.75)g，實(shí)驗(yàn)室溫度20～24℃，正常光照，自由飲食、活動(dòng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。隨機(jī)分為A組(健康對(duì)照組)，B組(糖尿病模型組)，C組(健康大鼠ATO干預(yù)組)，D組(糖尿病大鼠ATO干預(yù)組)各10只。

1.2試劑與設(shè)備 鏈尿佐菌素(STZ，美國(guó)sigma公司)，ATO鈣片(美國(guó)輝瑞公司)，化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)，全自動(dòng)生化分析儀(ES-380，南京頤蘭貝生物科技有限責(zé)任公司)，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)，RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國(guó)Thermo公司)，兔抗大鼠Smad2多克隆抗體、兔抗大鼠TGF-β1單克隆抗體、兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體(美國(guó)Santa公司)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗、生物素標(biāo)記羊抗兔IgG(上海英基生物科技有限公司)，ECL發(fā)光液(美國(guó)Millipore公司)，凝膠成像儀(美國(guó)UVP公司)，分光光度計(jì)(上海奧析科學(xué)儀器有限公司)，其他試劑均采用國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3方法

1.3.1模型制備 糖尿病組大鼠(B組與D組)，隔夜禁食12 h，每24 h腹腔注射STZ(55 mg/kg)，A組與C組同時(shí)腹腔注射同等劑量的生理鹽水，注射兩次。STZ處理48 h后，每只大鼠均隨機(jī)檢測(cè)2次尾靜脈血的血糖濃度，穩(wěn)定高于16.7 mmol/L，表明模型建立成功。建模成功后，進(jìn)行ATO干預(yù)：C組與D組將ATO鈣片溶于生理鹽水，制成0.5 mg/ml溶液，按10 mg·kg-1·d-1的劑量灌胃，持續(xù)8 w。同時(shí)，A組與B組將空白淀粉片溶于生理鹽水，制成0.5 mg/ml溶液，按10 mg·kg-1·d-1的劑量灌胃，持續(xù)8 w。

1.3.2樣本收集 ATO干預(yù)后的第1、2、4、8周，收集各組大鼠的24 h尿，檢測(cè)尿白蛋白(UAL)水平；尾靜脈采血檢測(cè)血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)含量。

干預(yù)8 w后，各組大鼠采用頸椎脫臼法處死。摘取腎臟，預(yù)冷的生理鹽水沖洗后，-20℃保存，左側(cè)腎組織預(yù)備用于檢測(cè)炎癥因子水平，另一側(cè)腎組織，待提取組織蛋白用于Western印跡檢測(cè)。

1.3.3生化檢查 CLIA法檢測(cè)尿中UAL含量，全自動(dòng)全化分析儀檢測(cè)血清BUN、Scr含量及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的空腹血糖值。

1.3.4ELISA檢測(cè)相關(guān)指標(biāo) ELISA檢測(cè)腎組織中白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10、前列腺素(PG)E2、腫瘤壞死因子(TNF)-α和C反應(yīng)蛋白(CRP)水平。上述實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3.5Western印跡法檢測(cè)TGF-β1和Smad2蛋白表達(dá) 取各組大鼠的腎組織，加入RIPA蛋白裂解液，勻漿后，提取組織總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫下5%脫脂奶粉振蕩封閉1 h，TBS-T洗膜，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體，兔抗大鼠Smad2多克隆抗體，兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜。TBS-T洗膜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，加ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，采用凝膠成像儀對(duì)蛋白條帶進(jìn)行觀察，獲取圖像，采用Image Lab軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析，記錄灰度值，同時(shí)計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠體重和空腹血糖情況 單因方差分析顯示8 w實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠的體重和空腹血糖比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D組大鼠體重明顯高于B組，但明顯低于A組和C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，C組與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；同時(shí)，B組與D組空腹血糖明顯高于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但D組與B組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組大鼠體重、空腹血糖比較

1)，2)，3)分別為與A，B，C組比較：P<0.05，下表同

2.2各組大鼠腎組織中炎癥因子的變化 單因素方差分析顯示，8 w實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠之間的腎內(nèi)炎癥因子水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與B組相比，D組大鼠腎組織中的炎癥因子(IL-1β、IL-6、IL-10、PGE2、TNF-α、CRP)水平顯著降低(P<0.05)，且與A組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而C組大鼠腎組織中炎癥因子的水平與A組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3各組大鼠腎功能的變化情況 經(jīng)兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析發(fā)現(xiàn)，各指標(biāo)組間整體差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而時(shí)間及分組與時(shí)間的交互作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)的8 w全過(guò)程中，A組與C組大鼠的腎功能各項(xiàng)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與A組相比，B組大鼠UAL、BUN、Scr水平顯著升高(P<0.05)；與C組相比，D組大鼠腎組織中UAL、BUN、Scr水平顯著升高(P<0.05)。在第1周和第2周時(shí)，D組大鼠腎組織中UAL、BUN、Scr水平與B組相對(duì)接近，實(shí)驗(yàn)第4周和第8周，D組腎組織中UAL、BUN、Scr水平顯著低于B組(P<0.05)，但仍明顯高于A組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠腎內(nèi)炎癥性因子水平比較

2.4各組大鼠腎臟組織TGF-β1和Smad2蛋白的表達(dá) Western印跡法結(jié)果經(jīng)單因素方差分析顯示，各組大鼠腎臟組織TGF-β1和Smad2蛋白的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D組腎組織中TGF-β1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平低于B組(P<0.05)，但仍然高于A組(P<0.05)。TGF-β1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平A組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。D組腎組織中Smad2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平低于B組(P<0.05)，但仍然高于A組(P<0.05)，Smad2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平在A組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4、圖1。

表3 各時(shí)相點(diǎn)大鼠的腎功能的指標(biāo)變化情況

1)，2)，3)分別為和A，B，C組相比：P<0.05；4)為和第1周相比：P<0.05；下表同

表4 各組大鼠腎臟組織TGF-β1和Smad2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖1 各組大鼠腎臟組織TGF-β1和Smad2蛋白表達(dá)水平

3 討 論

研究表明，糖尿病可導(dǎo)致多組織的慢性損害、功能障礙，如眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)等，由糖尿病并發(fā)癥導(dǎo)致的死亡僅次于心腦血管疾病和惡性腫瘤〔8，9〕。糖尿病按其發(fā)病原因可大致分為胰島素分泌缺陷或(和)胰島素作用缺陷。其中I型糖尿病是糖尿病的一種重要分型，屬于自身免疫性疾病，以胰島β細(xì)胞被進(jìn)行性破壞為特點(diǎn)，表現(xiàn)為胰島素分泌的絕對(duì)減少。廣譜抗生素STZ具有對(duì)胰島β細(xì)胞的選擇性毒性，能夠引起胰島素的絕對(duì)分泌不足，因而被廣泛用作糖尿病動(dòng)物模型的誘導(dǎo)劑。STZ已被證實(shí)能夠穩(wěn)定、高效地誘導(dǎo)建立大鼠1型糖尿病模型。

近年來(lái)，應(yīng)用非經(jīng)典糖尿病藥物防治糖尿病并發(fā)癥是糖尿病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。有研究認(rèn)為，他汀類藥物對(duì)糖尿病患者腎臟具有保護(hù)作用〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，ATO能夠增加糖尿病大鼠的體重，但對(duì)糖尿病大鼠的空腹血糖并無(wú)影響。

經(jīng)STZ誘導(dǎo)建立1型糖尿病模型后，腎功能受到明顯損害〔11〕，而單純ATO干預(yù)并不會(huì)影響健康大鼠的腎臟功能。從第4周開(kāi)始，D組大鼠腎功能指標(biāo)都較B組有所回落，提示經(jīng)ATO干預(yù)后大鼠的腎臟功能有所恢復(fù)?？梢?jiàn)ATO能夠減輕糖尿病對(duì)大鼠腎臟造成的損害〔12〕。

本研究表明ATO能夠減少糖尿病大鼠腎臟組織內(nèi)炎癥性因子〔13,14〕，從而降低糖尿病腎臟中的炎癥水平，同時(shí)并不會(huì)影響到正常健康的大鼠。已有研究證實(shí)，TGF-β1/Smads信號(hào)通路參與了糖尿病腎病的病情進(jìn)展過(guò)程〔15,16〕，TGF-β1過(guò)表達(dá)多會(huì)促進(jìn)糖尿病腎臟纖維化的發(fā)生〔17〕。本研究提示ATO能夠選擇性抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路活化。本研究推測(cè)，當(dāng)大鼠被STZ誘導(dǎo)建立起糖尿病模型后，TGF-β1/Smads信號(hào)通路活性增加，從而對(duì)腎臟造成一定的損害。當(dāng)ATO干預(yù)后，由于其能夠抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路，糖尿病腎臟所受損害在一定程度上得到了減輕。這可能也是ATO改善糖尿病大鼠腎功能的一種機(jī)制。

綜上所述，ATO能夠增加糖尿病大鼠的體重，并且不影響其空腹血糖；能夠減少糖尿病對(duì)腎臟的損害，保護(hù)腎臟，減少糖尿病腎病的發(fā)生。單純ATO干預(yù)不會(huì)對(duì)健康大鼠造成腎臟方面的不良影響，這為今后拓展糖尿病控制、治療的研究提供了新的方向。