轉(zhuǎn)錄因子-21對宮頸癌細胞放療敏感性及凋亡的影響

佐合拉古麗·木塔力甫 阿依努爾·色義提

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科放射治療二病區(qū)，新疆 烏魯木齊 830011)

目前隨著宮頸細胞學(xué)篩查的不斷推廣，宮頸癌的發(fā)病率有所下降，但仍然嚴重威脅女性的健康〔1〕。宮頸癌的治療以手術(shù)治療為主，由于大多數(shù)患者在確診時已處于中晚期，放化療已成為最為常用的輔助治療方法。轉(zhuǎn)錄因子(TCF)-21是一種抑癌基因，在肝癌、卵巢癌、胃癌等癌組織中表達下調(diào)，能夠影響腫瘤的生長〔2，3〕。有研究表明，TCF-21過表達后，肺腺癌細胞放化療敏感性均增加，細胞凋亡增多〔4〕。蛋白激酶B(Akt)磷酸化水平與腫瘤細胞的凋亡有關(guān)，且能夠調(diào)控腫瘤細胞的放療敏感性〔5〕。本研究旨在探討TCF-21對宮頸癌細胞放療敏感性及細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1組織及細胞 收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院在2015年1月至2017年2月收治的70例宮頸癌患者的宮頸癌組織及對應(yīng)的癌旁組織，所有患者在切除手術(shù)前沒有接受放療及化療，組織標本保存于液氮中，標本采集均經(jīng)過患者及家屬知情同意。宮頸癌細胞HeLa、CaSki、SiHa和正常宮頸上皮細胞End1/E6E7均購于中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2主要儀器及試劑 胎牛血清購于美國Gibco；K-SFM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購于美國Sigma；TCF-21和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物均由上海生工合成；pcDNA3.1空載體、TCF-21過表達載體(pcDNA3.1 TCF-21)均購于山東維真生物科技有限公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3單克隆抗體、Akt單克隆抗體、磷酸化Akt(p-Akt)單克隆抗體均購于美國Santa Cruz；紫外分光光度計、CO2培養(yǎng)箱均購于美國Thermo；RT-PCR試劑盒購于大連Takara；組織和蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)研究所；Lip2000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen。

1.3細胞培養(yǎng) 宮頸癌細胞HeLa、CaSki、SiHa用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，正常宮頸上皮細胞End1/E6E7用含有10%胎牛血清、0.1 ng/ml表皮生長因子的K-SFM培養(yǎng)液在37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察細胞密度超過90%時，用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。

1.4qRT-PCR檢測組織和細胞中TCF-21 mRNA表達水平 RNA提?。簩m頸癌細胞HeLa、CaSki、SiHa和正常宮頸上皮細胞End1/E6E7培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，按照每10 cm2細胞加入1 ml Trizol裂解細胞；宮頸癌組織及癌旁組織液氮研磨成粉狀，按照每50 mg加入1 ml Trizol裂解組織。將裂解液轉(zhuǎn)移到離心管中，放在室溫環(huán)境下靜置5 min，加入200 μl氯仿，上下劇烈振蕩15 s，室溫環(huán)境中靜置5 min。4℃，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液至EP管中，加入500 μl異丙醇，混勻后，室溫靜置10 min，4℃，12 000 r/min離心15 min，加入75%乙醇洗滌2次后，在室溫環(huán)境中干燥。吸取1 μl用于檢測RNA濃度及純度(紫外分光光度計檢測濃度及純度)。根據(jù)qRT-PCR試劑盒檢測TCF-21 mRNA水平。TCF-21上游引物5′-GGCAGATCCTGGCTAACGAC-3′，下游引物5′-CCTTTCCCAGACTCGCACC-3′。GAPDH上游引物5′-GGCAGATCCTGGCTAACGAC-3′，下游引物5′-CCTTTCCCAGACTCGCACC-3′。循環(huán)參數(shù)：95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個循環(huán)。內(nèi)參基因為GAPDH，2-△△Ct法計算TCF-21 mRNA水平。

1.5Western印跡檢測組織和細胞中TCF-21蛋白表達水平 按照蛋白提取試劑盒提取宮頸癌細胞HeLa、CaSki、SiHa和正常宮頸上皮細胞End1/E6E7、癌旁組織及宮頸癌組織中的蛋白。蛋白樣品濃度參照BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測。取蛋白樣品與5倍上樣緩沖液按照4∶1的比例混合后，煮沸變性。按照每孔加入40 μg蛋白樣品進行電泳，72 V電壓觀察溴酚藍進入分離膠和濃縮膠邊緣時，把電壓升高至120 V，觀察溴酚藍進入膠塊下端邊緣1 cm處，終止電泳。35 V電壓轉(zhuǎn)膜過夜。用含有5%牛血清白蛋白在室溫，搖床封閉2 h。與500倍稀釋的一抗在4℃孵育過夜后，與2 000倍稀釋的二抗在室溫環(huán)境中孵育90 min。顯色后，用目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

1.6細胞轉(zhuǎn)染及分組 SiHa細胞分為對照組、陰性組和過表達組，其中對照組不做處理，陰性組細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體，過表達組細胞轉(zhuǎn)染TCF-21過表達載體(pcDNA3.1 TCF-21)。在細胞轉(zhuǎn)染前1 h用不含血清的細胞培養(yǎng)液孵育1 h，用Lip2000轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA3.1和pcDNA3.1 TCF-21轉(zhuǎn)染至細胞中。48 h后，RT-PCR和Western印跡分別檢測細胞中TCF-21 mRNA和蛋白水平。步驟參照1.4和1.5。將轉(zhuǎn)染48 h后的SiHa細胞以6 MV光子線，100 cm源皮距，10 cm×10 cm照射野，劑量8 Gy放射處理。對照組細胞照射處理后為對照+放療組，過表達組細胞照射處理后為過表達+放療組。

1.7流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 對照組、過表達組、對照+放療組、過表達+放療組處理后培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化細胞，收集9×105個細胞，用200 μl結(jié)合緩沖液重懸，加入膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC和碘化丙啶(PI) 各5 μl，混勻，放置室溫環(huán)境下孵育10 min后，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.8細胞克隆實驗檢測細胞放療敏感性 對照組、過表達組培養(yǎng)48 h后，調(diào)整細胞濃度為每毫升含有3×106個細胞。接種至12孔細胞培養(yǎng)板中，0、2、4、6、8 Gy劑量照射處理細胞后，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)13 d。用肉眼觀察細胞克隆形成后，將細胞培養(yǎng)液倒掉，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次細胞，固定(甲醇，20 min)，染色(結(jié)晶紫，20 min)，用蒸餾水將染液沖洗掉，在顯微鏡下觀察大于50個的細胞克隆數(shù)目，計算細胞克隆形成率和細胞存活分數(shù)，擬合存活曲線。細胞克隆率=克隆數(shù)量÷接種的細胞數(shù)，細胞存活分數(shù)=受照射的細胞克隆形成率÷對照細胞的克隆形成率，放射增敏比(SER)=(對照組D0/藥物處理組D0)。

1.9Western印跡檢測酶切Caspase-3、Akt、p-Akt蛋白表達 對照組、過表達組、對照+放療組、過表達+放療組處理后培養(yǎng)48 h，收集細胞，按照1.5中步驟檢測酶切Caspase-3、Akt、p-Akt蛋白表達。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1TCF-21在宮頸癌組織和細胞中的表達 TCF-21 mRNA和蛋白在宮頸癌組織中的表達水平(0.36±0.04，0.11±0.03)明顯低于癌旁組織(1.00±0.09，0.35±0.04)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.320，8.314，P<0.05)。End1/E6E7、HeLa、CaSki、SiHa細胞中mRNA水平(1.00±0.11、0.46±0.03、0.34±0.03、0.22±0.02)和蛋白水平(0.42±0.03、0.23±0.02、0.14±0.02、0.07±0.01)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=99.441，153.111，均P=0.000)，TCF-21 mRNA和蛋白在宮頸癌細胞HeLa、CaSki、SiHa中的表達水平均明顯低于正常宮頸上皮細胞End1/E6E7(P<0.05)，且在SiHa細胞中表達最低。后續(xù)選用SiHa細胞為研究對象。見圖1，圖2。

圖1 TCF-21在宮頸癌組織中的表達

圖2 TCF-21在宮頸癌細胞中的表達

2.2轉(zhuǎn)染后細胞中TCF-21水平 對照組、陰性組、過表達組TCF-21 mRNA水平(1.00±0.08、1.01±0.12、2.17±0.14)和蛋白水平(0.10±0.02、0.09±0.04、0.58±0.06)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=100.790，126.054，均P=0.000)，陰性組mRNA和蛋白水平與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，過表達組均明顯高于對照組(t=12.348，13.607，P<0.05)。見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染后細胞中TCF-21表達水平

2.3TCF-21對細胞凋亡影響 對照組、過表達組、對照+放療組、過表達+放療組細胞凋亡率〔(8.77±2.58)%、(41.81±3.40)%、(36.63±2.63)%、(55.47±3.13)%〕差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=132.180，P=0.00)，對照+放療組、過表達組、過表達+放療組明顯高于對照組(t=11.547，13.694，19.355，P<0.05)。過表達+放療組明顯高于對照+放療組(t=7.808，P<0.05)。

2.4放療敏感性 過表達TCF-21能夠降低細胞存活分數(shù)，提高放療敏感性，SER為1.661。見圖4，表1。

圖4 細胞存活曲線

組別D0(Gy)Dq(Gy)NSF2kSER對照組2.0842.1942.8660.7490.480-過表達組1.2551.3482.9290.4860.7971.661

2.5細胞中酶切Caspase-3、Akt、p-Akt蛋白水平 4組酶切Caspase-3水平和p-Akt水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=65.427，45.114，均P=0.000)，而Akt水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.233，P=0.871)，對照+放療組、過表達組、過表達+放療組酶切Caspase-3水平明顯高于對照組(t=3.062，3.242，13.147，P<0.05)，過表達+放療組明顯高于對照+放療組(t=10.085，P<0.05)。對照+放療組、過表達組、過表達+放療組p-Akt水平明顯低于對照組(t=5.383，4.968，11.593，P<0.05)，過表達+放療組明顯低于對照+放療組(t=6.211，P<0.05)。見圖5，表2。

圖5 Western印跡檢測酶切Caspase-3、Akt、p-Akt蛋白水平

組別酶切Caspase-3Aktp-Akt對照組0.25±0.061.05±0.070.38±0.04過表達組0.43±0.061)1.08±0.060.26±0.031)對照+放療組0.42±0.071)1.09±0.040.25±0.031)過表達+放療組0.98±0.081)2)1.07±0.070.10±0.011)2)

與對照組比較:1)P<0.05；與對照+放療組比較:2)P<0.05

3 討 論

TCF-21基因定位于6q23-24，是堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族成員之一，能夠編碼TCF-21，其在肺、腸、腎等均廣泛表達〔6〕。最近的研究表明，TCF-21在多種癌癥如腎透明細胞癌、乳腺癌、膀胱癌、黑素瘤、頭頸鱗狀細胞癌等組織中表達異常下調(diào)，且與腫瘤細胞的多種生物學(xué)特性有關(guān)〔7～9〕。胡松等〔10〕研究表明，TCF-21能夠抑制肺癌細胞增殖，促進肺癌細胞凋亡。Tan等〔11〕發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中幾乎檢測不到TCF-21 mRNA和蛋白，而過表達TCF-21后肝癌細胞SMMC-7721的凋亡率從12%上升至50%。朱清華〔12〕研究表明，TCF-21 mRNA和蛋白在卵巢癌組織中的表達水平明顯低于正常的卵巢組織。本研究結(jié)果說明，TCF-21在宮頸癌中表達下調(diào)，可能是一種抑癌基因。

放療是目前治療腫瘤較為常用的輔助治療手段，通過靶向基因提高腫瘤細胞放療敏感性是目前較為常用的提高放療敏感性的方法〔13〕。陸曉等〔14〕研究表明，促進肺腺癌細胞A549中TCF-21表達后，通過放射處理后，裸鼠成瘤體積減少一半，細胞凋亡增多。本研究結(jié)果提示TCF-21能夠促進宮頸癌細胞凋亡，增加宮頸癌細胞放療敏感性。

腫瘤細胞凋亡與細胞多種基因的嚴格調(diào)控有關(guān)，是一系列蛋白經(jīng)過復(fù)雜調(diào)控的最終結(jié)果〔15〕。Caspase級聯(lián)反應(yīng)激活后能夠促進細胞凋亡的發(fā)生，而在Caspase級聯(lián)反應(yīng)中Caspase-3發(fā)揮凋亡執(zhí)行的作用，其活化后標志著細胞凋亡進入不可逆的階段〔16，17〕。Akt信號通路在多種組織和器官中均存在廣泛的生物學(xué)作用，參與細胞的生長、凋亡等過程〔18，19〕。在腫瘤組織中，Caspase-3活化水平受到抑制，P-Akt水平異常升高，Akt信號通路過度激活〔20〕。Zhang等〔21〕研究表明，Akt信號通路參與miRNA調(diào)控肝癌細胞放療敏感性的過程。本研究結(jié)果提示，TCF-21可能通過抑制Akt信號通路增加宮頸癌細胞放療敏感性，促進宮頸癌細胞凋亡。

綜上，TCF-21在宮頸癌組織和細胞中無論是在基因水平還是蛋白水平均明顯下調(diào)。TCF-21能夠促進宮頸癌細胞凋亡，且對放療誘導(dǎo)的宮頸癌細胞凋亡具有協(xié)同作用，能夠增加宮頸癌細胞放療敏感性。