克拉維酸鉀配伍阿莫西林治療對(duì)老年肺結(jié)核外周血自然殺傷細(xì)胞表面受體及肺組織中B、T淋巴細(xì)胞衰減子表達(dá)的影響

侯志強(qiáng) 齊亞萌

(天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津 300211)

老年肺結(jié)核病情不明顯，檢查結(jié)果容易受多種因素干擾，給病情的診斷和治療帶來了很大困難〔1〕。肺結(jié)核發(fā)病機(jī)制是由免疫功能損傷引起的〔2〕，老年患者的免疫功能減退也是老年人群易感的重要原因，若不能及時(shí)治療，病情迅速發(fā)展，則難以逆轉(zhuǎn)。自然殺傷(NK)細(xì)胞是構(gòu)成細(xì)胞免疫的重要部分，NK細(xì)胞的活化受抑制受體(NKG2A)和活化受體(NKG2D)的作用，兩者的表達(dá)平衡才能使得NK細(xì)胞發(fā)揮正常的作用〔3〕。研究表明B、T淋巴細(xì)胞衰減子(BTLA)在肺結(jié)核免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用〔4〕。克拉維酸鉀和阿莫西林是臨床上新興的治療肺結(jié)核的有效藥物，本研究探討克拉維酸鉀配伍阿莫西林治療老年肺結(jié)核對(duì)患者NK細(xì)胞表面受體NKG2A和NKG2D及BLTA表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2014年1月至2015年1月在天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院收治的老年肺結(jié)核患者120 例，所有患者符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)會(huì)制定的《肺結(jié)核診斷及治療指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕，納入標(biāo)準(zhǔn)：①痰檢結(jié)果顯示抗酸桿菌涂片為陽(yáng)性〔6，7〕，或痰菌陰性，經(jīng)培養(yǎng)顯示痰標(biāo)本中有結(jié)核分支桿菌；②經(jīng)胸部X線等影像學(xué)檢查確診為肺結(jié)核，有滲出性胸腔積液，或活動(dòng)性肺結(jié)核；③患者存在咯血、咳痰、盜汗、發(fā)熱、胸悶氣短等癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重心血管疾??；②肝腎功能異常；③肺塵埃沉著病、糖尿病等慢性病者；④有精神病史者。將所有患者隨機(jī)分為研究組及對(duì)照組，各60 例，研究組男37例，女23例，年齡60～82〔平均(68.5±3.7)〕歲，肺結(jié)核病史0～30〔平均(15.8±2.3)〕年，合并肺外結(jié)核32例(其中單側(cè)胸腔積液15例，雙側(cè)胸腔積液11例，雙肺彌漫間質(zhì)病變4例，亞急性血播型2例)。對(duì)照組男35例，女25例，年齡60～80〔平均(69.4±3.1)〕歲，肺結(jié)核病史0～29〔平均(15.1±2.6)〕年，合并肺外結(jié)核34例(其中單側(cè)胸腔積液16例，雙側(cè)胸腔積液10例，雙肺彌漫間質(zhì)病變5例，亞急性血播型3例)。兩組性別、年齡、病程等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究所有內(nèi)容經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬知情且簽署知情同意書。治療6個(gè)月后研究組患者有2人失訪，對(duì)照組患者有1人失訪，2人退出研究。

1.2方法 對(duì)照組采用左氧氟沙星治療，0.2 g/次， 3次/d，并在此基礎(chǔ)上加用力克肺疾(Dipasic，D，重慶華邦制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)20030903)0.2～0.3 g/次，3次/d，利福噴丁(上海信宜萬象藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：55131101)0.45 g/次，2次/w，鹽酸乙胺丁醇(杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：010863)0.75 g/次，頓服。研究組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用阿莫西林克拉維酸鉀分散片(4∶1)(浙江亞太藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：6121118)進(jìn)行治療，2片/次，3次/d。

1.3療效評(píng)價(jià) X線檢查評(píng)價(jià)肺部病灶吸收情況：顯效：病灶全部吸收或吸收1/2以上；有效：病灶出現(xiàn)明顯吸收，但吸收在1/2及以下；無效：病灶無吸收，或進(jìn)一步惡化〔8〕。顯效率=顯效/患者總數(shù)×100%，有效率=(顯效+有效)/患者總數(shù)×100%。

1.4觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法 分別于治療前、治療后3、6個(gè)月觀察痰菌陰轉(zhuǎn)率、肺部病灶吸收、空洞閉合率情況、NK細(xì)胞表面受體表達(dá)率、肺組織中BTLA表達(dá)情況及不良反應(yīng)發(fā)生率。

1.4.1NKG2A和NKG2D檢測(cè) NKG2A檢測(cè)：所有患者于治療前、治療后3、6個(gè)月空腹?fàn)顟B(tài)下抽取2 ml上肢靜脈血，加入EDTA抗凝，將其與等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻，并注入淋巴細(xì)胞分離液表面，將核細(xì)胞分離并用PBS緩沖液沖洗得細(xì)胞懸液，于1 200 r/min離心5 min，留沉淀并用100 μl PBS緩沖液重懸。向管內(nèi)各加入10 μl的NKG2A-PE、CD56-FITC及CD3-PE-Cy5(購(gòu)自R&D System公司)。NKG2D檢測(cè)：向管內(nèi)加入NKG2D-PE、CD56-FITC及CD3-PE-Cy5(購(gòu)自R&D System公司)，其余步驟相同，于4℃下放置30 min。同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照。于1 000 r/min離心10 min，棄去上清，PBS緩沖液沖洗兩次，移入流式管中待測(cè)。NKG2A和NKG2D檢測(cè)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行。分析結(jié)果，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.4.2BTLA表達(dá)測(cè)定 采用PV二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒均購(gòu)自R&D System公司，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。取5 μm的組織切片，常規(guī)脫蠟，用1%的過氧化氫(H2O2)處理，然后高壓修復(fù)2 min，采用鼠抗人BTLA單克隆一抗(1∶150濃度)于4℃下放置過夜，然后用PBS緩沖液沖洗干凈，滴加二抗，37℃孵育，最后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色及蘇木精染色。圖像分析采用IPWin32采集系統(tǒng)進(jìn)行，行組織化學(xué)染色BTLA免疫組織化學(xué)(IHC)評(píng)分，并半定量分析BTLA的表達(dá)水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件行χ2及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組痰菌轉(zhuǎn)陰率比較 治療3個(gè)月，研究組痰菌轉(zhuǎn)移率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；治療6個(gè)月，兩組痰菌轉(zhuǎn)陰率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2兩組肺部病灶吸收情況比較 治療3個(gè)月，研究組病灶吸收顯效率和有效率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；治療6個(gè)月，研究組顯效率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，兩組有效率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3兩組空洞閉合率比較 治療3個(gè)月和治療6個(gè)月時(shí)，研究組空洞閉合率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表1 兩組痰菌轉(zhuǎn)陰率比較〔n(%)〕

表2 兩組肺部病灶吸收情況比較〔n(%)〕

表3 兩組空洞閉合率比較〔n(%)〕

2.4兩組NKG2A和NKG2D表達(dá)水平比較 治療前，兩組NKG2A和NKG2D陽(yáng)性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療3個(gè)月和6個(gè)月時(shí)，兩組NKG2A陽(yáng)性率顯著降低，NKG2D陽(yáng)性率顯著升高，與治療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，研究組NKG2A陽(yáng)性率顯著降低NKG2D陽(yáng)性率顯著增高(P<0.05)。見表4。

2.5兩組BTLA水平比較 治療前兩組BTLA IHC評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療3個(gè)月與6個(gè)月時(shí)，兩組BTLA IHC評(píng)分均顯著降低(P<0.06)，且研究組與對(duì)照組比較評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見表5。

2.6兩組不良反應(yīng)比較 兩組惡心、肝功能損傷、食欲不佳等不良反應(yīng)發(fā)生情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均經(jīng)治療得到恢復(fù)，且對(duì)其正常治療無影響。見表6。

表4 兩組NKG2A和NKG2D陽(yáng)性率比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，與本組治療前比較：2)P<0.05，下表同

表5 兩組BTLA IHC評(píng)分比較分)

表6 兩組不良反應(yīng)發(fā)生情況比較〔n(%)〕

3 討 論

老年人群具有生理、心理等的相對(duì)脆弱性，相比于年輕人群對(duì)肺結(jié)核的抵抗能力差，身體各器官功能及眾多并發(fā)癥導(dǎo)致藥物治療效果降低、不良反應(yīng)發(fā)生驟增，且患者的治療連續(xù)性、依從性差。本研究顯示克拉維酸鉀配伍阿莫西林治療痰菌轉(zhuǎn)陰率高，療效確切。目前，臨床上應(yīng)用克拉維酸鉀配伍阿莫西林治療肺結(jié)核耐藥菌株少，利于小劑量就可以發(fā)揮治療效果。隨著肺結(jié)核疾病進(jìn)展，病灶部位會(huì)出現(xiàn)慢性纖維空洞、病灶滲出液、胸膜粘連等，進(jìn)而導(dǎo)致病情轉(zhuǎn)移造成難以回逆的器官損害，患者也會(huì)出現(xiàn)咯血、咳膿痰、咳嗽等情況〔9〕，此時(shí)必須聯(lián)合一定量的抗生素進(jìn)行治療。阿莫西林克拉維酸鉀分散片是羥氨芐青霉素和克拉維酸(β-內(nèi)酰胺酶抑制劑)的復(fù)合藥物，其中的克拉維酸能夠增強(qiáng)阿莫西林的抗菌活性，拓寬抗菌種類，有利于減少耐藥菌的產(chǎn)生〔10，11〕。

NK細(xì)胞是體內(nèi)多種免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)細(xì)胞，肺結(jié)核能夠?qū)е聶C(jī)體內(nèi)NK細(xì)胞數(shù)量下降和活性顯著降低。NK細(xì)胞的活性受其表面受體NKG2A和NKG2D的影響，NKG2A和NKG2D通過傳遞抑制和活化信號(hào)，調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性，同時(shí)NK細(xì)胞進(jìn)過達(dá)CD56〔12〕。本研究表明克拉維酸鉀配伍阿莫西林能夠提升NK活性。當(dāng)結(jié)核菌入侵到機(jī)體內(nèi)后，若機(jī)體的抵抗作用較強(qiáng)，結(jié)核菌會(huì)轉(zhuǎn)為隱性感染，而當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，結(jié)核菌會(huì)轉(zhuǎn)為顯性感染，并開始向其他部位擴(kuò)散。研究表明，正常人群的外周血NK細(xì)胞活性顯著高于肺結(jié)核人群，NKG2A表達(dá)增加，這與本研究的結(jié)果相似。肺組織BTLA是一類免疫球蛋白的相關(guān)性蛋白，BTLA能夠與皰疹病毒侵入介質(zhì)(HVEM)結(jié)合，活化相應(yīng)抑制性信號(hào)通路。BTLA在T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞中均有表達(dá)〔13〕。在肺結(jié)核發(fā)病中，BLTA參與了病原菌對(duì)肺組織的免疫損傷過程。面對(duì)老年肺結(jié)核人群，需要更加合理的方案，做到治療期間安全有效、副作用少、能明顯改善患者癥狀，提升患者生存質(zhì)量，并在長(zhǎng)期上降低其復(fù)發(fā)率?？死S酸鉀配伍阿莫西林是近期新興的治療肺結(jié)核的藥物，臨床上具有利于痰菌轉(zhuǎn)陰、低毒性、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，聯(lián)合乙胺丁醇使用更具有良好的殺菌效果。本研究顯示，對(duì)老年肺結(jié)核患者采用含阿莫西林克拉維酸鉀分散片的聯(lián)合治療方案,近期療效確切,藥物不良反應(yīng)少,能夠顯著改善患者的免疫功能狀態(tài)，調(diào)節(jié)NKG2A、NKG2D及BTLA的表達(dá)。