GmHMADP參與高溫高濕下大豆種子活力形成及銅鎘脅迫響應(yīng)的研究

朱雅婧，周亞麗，劉骕骦，魏家萍，劉小林，沈英姿，趙海紅，麻浩

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095）

0 引言

【研究意義】大豆（Glycine max[L.] Merrill）是世界上重要的經(jīng)濟(jì)和糧食作物之一，也是中國(guó)的戰(zhàn)略性物資。高溫高濕、重金屬等非生物脅迫是制約大豆生產(chǎn)，影響種子發(fā)育及品質(zhì)的重要因子。中國(guó)南方春大豆在種子生理成熟期（R6期—R7期），常處于高溫、多雨的季節(jié)，極易發(fā)生田間劣變，導(dǎo)致種子活力下降，嚴(yán)重制約了春大豆的生產(chǎn)[1-2]。另外，重金屬污染也是當(dāng)前不容忽視的污染問題之一，中國(guó)受重金屬污染的耕地面積達(dá) 2.0×107hm2，約占全國(guó)耕地總面積的20%，造成糧食減產(chǎn)1.0×107t[3]。重金屬污染不僅嚴(yán)重影響作物生長(zhǎng)發(fā)育，而且能夠通過食物鏈危害人體健康[4]。Cu、Cd是當(dāng)今污染較為嚴(yán)重與普遍的重金屬，其對(duì)作物產(chǎn)生傷害的臨界濃度普遍較低，即使較低濃度的脅迫也會(huì)影響作物生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而降低產(chǎn)量、影響品質(zhì)[5]。而大豆是對(duì)Cu、Cd較為敏感的作物，Cu、Cd脅迫會(huì)影響大豆根系活力和植株形態(tài)，最終造成大豆減產(chǎn)[3,6]。因此，選育高活力的逆境耐受性大豆新品種尤為迫切?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】種子活力是衡量種子質(zhì)量的一個(gè)綜合指標(biāo)，其與田間出苗率關(guān)系緊密，直接影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。一般情況下，當(dāng)種子處于生理成熟期時(shí)，種子活力達(dá)到最大，隨后由于老化或者受到環(huán)境因素等的影響，會(huì)出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的質(zhì)量下降變化，即種子劣變[7]。種子劣變后會(huì)導(dǎo)致種子貯藏力和種子質(zhì)量下降，萌發(fā)及生長(zhǎng)緩慢，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和整齊率降低，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致生活力喪失，進(jìn)而對(duì)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[8-9]。高溫高濕脅迫是導(dǎo)致春大豆種子田間劣變發(fā)生的重要因素之一[10]。然而，目前有關(guān)種子田間劣變的分子機(jī)制研究尚不夠深入。本研究團(tuán)隊(duì)在大豆種子田間劣變抗性的機(jī)制研究方面取得了一定進(jìn)展，WANG等[11]從92份春大豆地方品種和推廣品種中篩選到了種子田間劣變抗性品種湘豆3號(hào)和不抗品種寧鎮(zhèn)1號(hào)，并通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)GmSBH1經(jīng)高溫高濕脅迫后，在寧鎮(zhèn)1號(hào)中顯著上調(diào)表達(dá)；SHU等[12]研究表明，GmSBH1能夠響應(yīng)高溫高濕脅迫，并參與種子活力形成；陶源[13]進(jìn)一步以GmSBH1為誘餌蛋白，通過對(duì)大豆高溫高濕酵母雙雜交cDNA文庫進(jìn)行篩選，得到一個(gè)可能與之互作的大豆重金屬相關(guān)域包含蛋白（Glycine maxheavy-metalassociated domain-containing protein，GmHMADP）。目前，重金屬域包含蛋白研究較多的主要是重金屬ATP 酶（heavy metal transporting ATPases，HMAs）與重金屬相關(guān)異戊二烯植物蛋白（heavy metalassociated isoprenylated plant proteins，HIPPs）。研究表明，HMAs不僅能夠轉(zhuǎn)運(yùn)一些必需金屬離子（Cu+、Zn2+和Co2+），而且能夠運(yùn)輸重金屬離子（Cu2+、Cd2+和Pb2+）[14-20]。HIPPs是含有金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域（HMA）和 C–端異戊二烯基序（CaaX）的金屬伴侶。大量研究表明，HIPPs能夠參與重金屬的代謝和解毒、生物和非生物脅迫以及花和種子的發(fā)育[21-23]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，有關(guān)重金屬域包含蛋白的研究主要集中在擬南芥和水稻等模式作物，在大豆中的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究克隆大豆GmHMADP，對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，研究其在重金屬Cu、Cd以及高溫高濕脅迫下的表達(dá)水平及功能，以期為利用基因工程手段培育新的高活力的大豆抗性品種提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2015年9月至2017年12月進(jìn)行。供試大豆材料為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種植創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室麻浩教授課題組通過溫箱蝕化法對(duì) 92份南方春大豆地方品種和推廣品種篩選得到的種子田間劣變抗性品種湘豆3號(hào)與不抗品種寧鎮(zhèn)1號(hào)。試驗(yàn)所需大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自南京博爾迪生物技術(shù)公司；EHA105擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化菌株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T載體購(gòu)自TaKaRa公司；植物瞬時(shí)表達(dá)載體pA7-GFP以及植物表達(dá)載體pBI121-GUS由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 總DNA和RNA的提取及cDNA的合成

以2周苗齡的大豆幼葉為材料，采用CTAB法提取基因組總DNA；參照新型植物總RNA提取試劑盒說明書提取大豆材料的 RNA，并采用 TaKaRa公司RTase M-MLV試劑盒合成第一鏈cDNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 大豆GmHMADP的分離與氨基酸序列分析

根據(jù)NCBI公布的GmHMADP序列（GenBank登錄號(hào)XM_006580986.1），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1），分別以寧鎮(zhèn)1號(hào)和湘豆3號(hào)幼葉的DNA和cDNA為模板，對(duì)應(yīng)引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系及反應(yīng)程序參照LIU等[24]方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖電泳凝膠檢測(cè)后回收，并與 pMD19-T simple vector載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆送至南京鉑尚生物技術(shù)公司測(cè)序，并將正確的克隆命名為T-GmHMAD。并通過NCBI網(wǎng)站BLAST對(duì)同源性氨基酸序列進(jìn)行搜索，并用DNAMAN軟件分析不同來源氨基酸序列的相似性。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Sequences of primers used in this study

1.4 GmHMADP的表達(dá)分析

大豆種子用次氯酸鈉進(jìn)行消毒，置于培養(yǎng)皿，25℃催芽2—3 d，隨后將萌動(dòng)的種子播種于裝有營(yíng)養(yǎng)土的花盆，置于室外自然條件下生長(zhǎng)。生長(zhǎng)至一節(jié)期（V1）時(shí)采集大豆植株的子葉、根、莖及葉；盛花期（R2）取花；盛莢期（R4）取幼莢和幼嫩的豆粒；完熟期（R8）取成熟的莢和成熟的豆粒，用于組織特異性表達(dá)分析。植株生長(zhǎng)至種子生理成熟期（R7期）時(shí)，將植株轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫高濕處理。處理：白天40℃、RH 100%、10 h/黑夜30℃、RH 70 %、14 h；對(duì)照：白天30℃、RH 75 %、10 h/黑夜20℃、RH 70 %、14 h。分別收獲處理及對(duì)照組0、6、12、24、48、96和168 h的種子，用于高溫高濕脅迫下的表達(dá)模式分析。大豆種子消毒后，播種于1/2 MS固體培養(yǎng)基于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，將發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)移至水培營(yíng)養(yǎng)液中固定生長(zhǎng)，培養(yǎng)7 d后，將長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗分別移至含有 0（空白對(duì)照）、50、100 和 200 μmol·L-1的CuSO4與CdCl2的水培營(yíng)養(yǎng)液中，培養(yǎng)處理24 h。每個(gè)處理各選取10棵大豆幼苗的根系用于Cu、Cd脅迫下的表達(dá)模式分析。

所有樣品迅速用液氮冷凍5 min，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。qRT-PCR參照WANG等[10]方法進(jìn)行，所有試驗(yàn)均設(shè)置3次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。

1.5 GmHMADP蛋白的亞細(xì)胞定位

以T-GmHMAD為模板擴(kuò)增回收目的片段，用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和SalⅠ酶切載體pA7-GFP，采用同源重組法將目的基因構(gòu)建到pA7-GFP表達(dá)載體上，獲得35S::GmHMAD-GFP融合蛋白表達(dá)載體。取新鮮幼嫩的煙草葉片平鋪在MS培養(yǎng)基上，22℃培養(yǎng)3—4 h。采用PDS-1000/He基因槍（Bio-Rad）轉(zhuǎn)化煙草葉片的葉肉細(xì)胞，黑暗條件下23℃培養(yǎng)12—16 h，于激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP蛋白表達(dá)信號(hào)。

1.6 擬南芥轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因純合植株的獲得

用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和BamHⅠ酶切植物表達(dá)載體 pBI121-GUS，通過同源重組法獲得 pBI121-GmHMADP::GUS重組質(zhì)粒，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥（WT）。經(jīng)篩選鑒定得到 3個(gè)GmHMADP過表達(dá)陽性株系 HMADP-1、HMADP-3和HMADP-6，分別收獲純合的T3代轉(zhuǎn)基因種子進(jìn)行功能分析試驗(yàn)。

1.7 GmHMADP轉(zhuǎn)基因純合 T3擬南芥的脅迫處理及表型分析

將純合的GmHMADP過表達(dá)株系HMADP-1、HMADP-3和 HMADP-6以及野生型擬南芥種子播種于MS培養(yǎng)基，生長(zhǎng)14 d后移至含有營(yíng)養(yǎng)土和蛭石的花盆中，待黃熟期置于高溫高濕下處理2 d，以正常生長(zhǎng)條件下的植株作對(duì)照。待種子收獲后，處理組和對(duì)照組的擬南芥種子分別取 100粒點(diǎn)播于MS培養(yǎng)基上，播種后第 1天至第7天，每天記錄種子的發(fā)芽數(shù)，統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及平均發(fā)芽天數(shù)。此外，將野生型擬南芥種子和GmHMADP過表達(dá)株系 T3代種子分別播種于含有 1 μmol·L-1CuSO4、CdCl2的 MS 培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)6 d后，將部分幼苗分別轉(zhuǎn)移至含有50 μmol·L-1CuSO4、CdCl2的MS培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)生長(zhǎng)10 d，觀察植株的表型，并統(tǒng)計(jì)分析幼苗的主根長(zhǎng)以及干重，根長(zhǎng)與干重均以30株計(jì)算。所有試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

利用軟件DPS進(jìn)行方差（ANOVA）分析，檢測(cè)差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 GmHMADP的分離與氨基酸序列分析

分別以湘豆3號(hào)和寧鎮(zhèn)1號(hào)的cDNA為模板，利用特異性引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條996 bp的條帶，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)該基因的cDNA序列在2個(gè)品種間沒有差異。進(jìn)一步分別以湘豆3號(hào)和不抗品種寧鎮(zhèn)1號(hào)葉片DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1814 bp的GmHMADP的DNA序列，將測(cè)序得到的cDNA與DNA序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GmHMADP由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成（圖 1-A）。通過NCBI網(wǎng)站對(duì)GmHMADP進(jìn)行BLASTP搜索，并將與其相似性高的大豆（Glycine max，KRH54159.1）、赤豆（Vigna angularis，XP_017420608.1）、綠豆（Vigna radiata，XP_014500166.1）和狹葉羽扇豆（Lupinus angustifolius，XP_019464718.1）進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)僅有大豆（Glycine max，KRH54159.1）的氨基酸序列相似性最高，達(dá)99%。同時(shí)，這些蛋白均含有HMA結(jié)構(gòu)域，并且具有2個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)特征序列CXXC（圖1-B）。

2.2 GmHMADP的亞細(xì)胞定位

利用基因槍介導(dǎo)法將構(gòu)建的融合表達(dá)載體 35S::GmHMADP-GFP和 35S::GFP分別轉(zhuǎn)入煙草葉肉細(xì)胞，并對(duì)煙草葉肉細(xì)胞中的GFP蛋白信號(hào)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)35S::GmHMADP-GFP融合蛋白信號(hào)分布在細(xì)胞核與細(xì)胞膜上，且分別與核Marker蛋白mCherry和膜Marker蛋白pm-ck CD3-1001信號(hào)重合（圖2）。結(jié)果表明，GmHMADP編碼的產(chǎn)物定位于細(xì)胞核與細(xì)胞膜上。

圖1 GmHMADP結(jié)構(gòu)示意圖及GmHMADP與其他物種氨基酸序列多重比對(duì)Fig. 1 Schematic representation of the gene structures GmHMADP and multiple alignment of the GmHMADP amino acid sequences and other plants

2.3 GmHMADP的組織表達(dá)分析

為了解GmHMADP在大豆不同組織器官中的表達(dá)特性，分別調(diào)查GmHMADP在湘豆 3號(hào)和寧鎮(zhèn) 1號(hào)2個(gè)品種中根、莖、葉、花、子葉、發(fā)育中的莢、成熟的莢、發(fā)育中的種子以及成熟的種子中的表達(dá)情況。qRT-PCR結(jié)果表明，GmHMADP在2個(gè)品種的各組織器官中均有表達(dá)，且在發(fā)育中的種子和成熟的種子中表達(dá)量較高（圖3）。

2.4 大豆種子發(fā)育過程中GmHMADP的表達(dá)特性

組織表達(dá)研究表明，GmHMADP在種子中表達(dá)量較高，因此進(jìn)一步對(duì)GmHMADP在湘豆3號(hào)和寧鎮(zhèn)1號(hào)的種子發(fā)育過程中的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，在2個(gè)品種的種子發(fā)育過程中，GmHMADP總體呈先上升后下降的表達(dá)趨勢(shì)，且在花后40 d表達(dá)量達(dá)到最高（圖4）。以上結(jié)果表明，GmHMADP可能參與了種子發(fā)育過程。

2.5 高溫高濕脅迫下GmHMADP的表達(dá)特性

大豆植株在種子生理成熟期經(jīng)高溫高濕脅迫處理后，在不抗品種寧鎮(zhèn)1號(hào)種子中，GmHMADP在脅迫處理48、96和168 h時(shí)表達(dá)量顯著（P＜0.01）上升（圖5-A），

而在抗性品種湘豆3號(hào)中，該基因在處理24、48、96和168 h時(shí)表達(dá)量顯著（P＜0.01）上升（圖5-B）。以上結(jié)果表明，GmHMADP響應(yīng)了高溫高濕脅迫，并推測(cè)其可能參與了春大豆種子田間劣變抗性過程。

圖2 GmHMADP在煙草葉肉細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Fig. 2 Subcellular localization of GmHMADP protein in N.benthamiana mesophyll cells

圖3 大豆不同組織器官中GmHMADP的相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 The relative expression of GmHMADP gene in different soybean organs

圖4 大豆種子發(fā)育過程中GmHMADP的相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 The relative expression of GmHMADP gene in developing soybean seed

圖5 高溫高濕脅迫下的大豆種子中的GmHMADP的相對(duì)表達(dá)量Fig. 5 The relative expression of GmHMADP gene in soybean seeds under HTH stress

2.6 Cu、Cd脅迫下GmHMADP的表達(dá)特性

為了進(jìn)一步研究GmHMADP對(duì)重金屬脅迫的響應(yīng)特征，通過qRT-PCR技術(shù)對(duì)不同濃度CuSO4、CdCl2處理24 h的大豆幼苗中的GmHMADP進(jìn)行表達(dá)模式分析。在寧鎮(zhèn)1號(hào)幼苗的根中，50 μmol·L-1CuSO4和200 μmol·L-1CdCl2脅迫下GmHMADP表達(dá)量顯著（P＜0.01）高于對(duì)照；在抗性品種湘豆3號(hào)中，不同濃度CuSO4、CdCl2脅迫處理后，GmHMADP表達(dá)量均顯著（P＜0.01）上調(diào)（圖 6-A 與圖 6-B）。表明GmHMADP受Cu2+和Cd2+的誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)其可能參與重金屬Cu和Cd的脅迫。

2.7 高溫高濕脅迫下 GmHMADP過表達(dá)擬南芥種子的活力分析

研究表明，正常生長(zhǎng)條件下收獲的 WT和GmHMADP過表達(dá)植株的種子在第 7天的發(fā)芽率均能達(dá)到90%以上，且均能正常生長(zhǎng)成為幼苗，而在高溫高濕環(huán)境下收獲的各個(gè)株系種子的發(fā)芽率均有所下降，但GmHMADP過表達(dá)擬南芥株系的下降幅度最小，情況優(yōu)于WT（圖7-A）；表2顯示，在高溫高濕環(huán)境中收獲的WT和GmHMADP過表達(dá)植株種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)以及活力指數(shù)均明顯低于在正常生長(zhǎng)環(huán)境中收獲的種子，但GmHMADP過表達(dá)株系種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著（P＜0.01）優(yōu)于WT；而且脅迫后GmHMADP過表達(dá)植株種子的平均發(fā)芽天數(shù)明顯（P＜0.01）較WT種子短。結(jié)果表明，GmHMADP過表達(dá)株系的種子活力顯著高于野生型。

圖6 不同濃度CuSO4和CdCl2處理下的大豆幼苗根中的GmHMADP的相對(duì)表達(dá)量Fig. 6 The relative expression of GmHMADP gene under different concentration of CuSO4 and CdCl2 stress in soybean seedling roots

表2 高溫高濕處理對(duì)擬南芥種子萌發(fā)特性的影響Table 2 The Effect of HTH stress on germination of Arabidopsis seeds

2.8 Cu、Cd脅迫下GmHMADP過表達(dá)擬南芥的耐性分析

研究表明，經(jīng)過 1 μmol·L-1CuSO4處理后，GmHMADP過表達(dá)擬南芥株系幼苗的根長(zhǎng)均長(zhǎng)于WT，且過表達(dá)株系HMADP-2和HMADP-3達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；50 μmol·L-1CuSO4處理下GmHMADP過表達(dá)擬南芥株系的根長(zhǎng)均顯著（P＜0.01）長(zhǎng)于WT（圖8-A、圖8-C和圖8-E）；經(jīng)過1和50 μmol·L-1CdCl2處理后，GmHMADP過表達(dá)株系的根長(zhǎng)均顯著（P＜0.01）長(zhǎng)于WT（圖8-B、圖8-D和圖8-F）。通過對(duì)GmHMADP過表達(dá)擬南芥株系以及WT植株幼苗的干重進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，低濃度與高濃度的CuSO4和CdCl2脅迫下，GmHMADP過表達(dá)擬南芥株系的干重均顯著（P＜0.05）高于WT（圖8-G和圖8-H）。以上結(jié)果表明，GmHMADP在擬南芥中過表達(dá)能夠提高對(duì)Cu、Cd脅迫的抗性。

圖7 高溫高濕脅迫對(duì)擬南芥種子發(fā)芽率的影響Fig. 7 Effect on germination percentage of Arabidopsis seeds under HTH stress

3 討論

本研究分離了大豆重金屬相關(guān)域包含蛋白基因GmHMADP，并通過氨基酸多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其含有HMA保守結(jié)構(gòu)域，而且具有2個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)特征序列 CXXC。含有重金屬相關(guān)結(jié)構(gòu)域（heavymetal-associated domain，HMA）的蛋白能夠通過與細(xì)胞內(nèi)各種酶和輔因子結(jié)合完成金屬離子的時(shí)空運(yùn)輸，從而對(duì)重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)、解毒起重要作用[25]。表明GmHMADP可能與含有HMA結(jié)構(gòu)域的基因在植物生命活動(dòng)中發(fā)揮相似的功能。已有研究表明，含有HMA結(jié)構(gòu)域的HMAs家族蛋白多定位于細(xì)胞膜與液泡膜，參與重金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)[26-28]；HIPPs家族蛋白多定位于細(xì)胞核，參與冷害、鹽害和干旱等非生物脅迫[21-23,29]。此外，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，可能與 GmHMADP發(fā)生互作的GmSBH1蛋白定位于細(xì)胞核[12-13]。本研究亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示GmHMADP編碼的蛋白定位于細(xì)胞核與細(xì)胞膜上，由此推測(cè)，GmHMADP與GmSBH1可能在細(xì)胞核上發(fā)生互作，并在重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)及非生物脅迫響應(yīng)等方面發(fā)揮著作用，但需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

目前，關(guān)于含有HMA結(jié)構(gòu)域基因的組織特異性表達(dá)分析表明，大麥HvHMA1在籽粒中的表達(dá)量較高，其參與谷物萌發(fā)期和灌漿期糊粉層細(xì)胞中 Cu2+和Zn2+的運(yùn)輸[15]。水稻OsHMA2不僅在根尖成熟區(qū)表達(dá)[30-31]，同時(shí)也在花序、花藥、雌蕊、子房和胚芽中表達(dá)，能夠參與花序形成過程中及種子成熟階段Zn2+的運(yùn)輸[32]。也有研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtHIPP3參與生物脅迫以及花和種子的發(fā)育[23]。本研究基因組織特異性表達(dá)結(jié)果顯示GmHMADP在種子中大量表達(dá)，表明GmHMADP可能參與種子發(fā)育。此外，本研究通過對(duì)高溫高濕脅迫下該基因在大豆種子中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GmHMADP在轉(zhuǎn)錄水平上響應(yīng)高溫高濕脅迫，與SHU等[12]研究中的可能與GmHMADP互作的GmSBH1蛋白在高溫高濕脅迫下的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，由此推測(cè)GmHMADP可能通過與GmSBH1的互作協(xié)同響應(yīng)高溫高濕脅迫。另外，本研究中高溫高濕脅迫處理后收獲的GmHMADP過表達(dá)擬南芥植株種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)以及活力指數(shù)均明顯優(yōu)于野生型擬南芥，且過表達(dá)株系種子的平均發(fā)芽天數(shù)明顯縮短，表明GmHMADP過表達(dá)可提高擬南芥的種子活力。

鎘的移動(dòng)性強(qiáng)、毒性高，其位居“五毒重金屬”（汞、鎘、鉛、鉻、砷）第二位[33]。植物受到鎘脅迫，呼吸和光合作用受到影響，植株生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，導(dǎo)致植株生物量下降，干質(zhì)量減輕[34]。研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫能夠抑制大豆、綠豆等豆科作物種子的萌發(fā)[35-36]。而銅是中國(guó)第四大農(nóng)田重金屬污染源[37]，過量時(shí)能夠增強(qiáng)活性氧的產(chǎn)生，造成細(xì)胞損傷，影響植株生長(zhǎng)，尤其是對(duì)根的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，最終造成產(chǎn)量下降[6,38]。KULIKOVA等[6]研究表明，隨著銅濃度的增高，銅對(duì)大豆根生長(zhǎng)的抑制率逐漸升高，當(dāng)銅含量達(dá)到50 μmol·L-1時(shí)，根部生長(zhǎng)完全停止。因此，對(duì)大豆抗銅、鎘脅迫分子機(jī)制的研究尤為重要。由于土壤中的Cu和Cd通常以離子態(tài)或絡(luò)合態(tài)進(jìn)入植物體內(nèi)，從而對(duì)植物產(chǎn)生毒害[3]，因此本研究以含有CuSO4和CdCl2的水培營(yíng)養(yǎng)液對(duì)大豆幼苗處理 24 h，qRT-PCR結(jié)果表明，在不同濃度的 Cu2+、Cd2+處理下，湘豆 3號(hào)幼苗根中GmHMADP的表達(dá)量均顯著增加；而寧鎮(zhèn)1 號(hào)品種中，僅在 50 μmol·L-1CuSO4和 200 μmol·L-1CdCl2處理下GmHMADP表達(dá)量顯著增加。以上試驗(yàn)結(jié)果表明GmHMADP在轉(zhuǎn)錄水平上能夠響應(yīng)Cu和Cd脅迫。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)GmHMADP的cDNA序列在2個(gè)品種間并沒有差異，但經(jīng)Cu、Cd處理后在寧鎮(zhèn)1號(hào)和湘豆3號(hào)2個(gè)品種中該基因表達(dá)存在明顯差異，那么這種現(xiàn)象究竟是由什么原因造成的呢？前人研究表明，啟動(dòng)子序列差異影響下游基因表達(dá)[39-40]。因此，推測(cè)該結(jié)果可能是由于該基因上游啟動(dòng)子序列在2個(gè)品種間存在一定差異，這仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。另外，VERRET等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在Zn、Cd和Co的毒害下，AtHMA4過表達(dá)促進(jìn)了擬南芥根系的生長(zhǎng)，增強(qiáng)了植株對(duì)重金屬脅迫的抗性。本研究通過對(duì)CuSO4、CdCl2處理下GmHMADP過表達(dá)擬南芥植株的根長(zhǎng)以及干重的研究，發(fā)現(xiàn) CuSO4、CdCl2處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的根長(zhǎng)以及干重均顯著高于野生型，表明GmHMADP可提高植株對(duì)Cu、Cd脅迫的耐受性。

圖8 不同濃度CuSO4、CdCl2對(duì)擬南芥幼苗的根長(zhǎng)與干重的影響Fig. 8 Effect on root length and dry weight(DW) of Arabidopsis seedlings under different concentration of CuSO4 and CdCl2

4 結(jié)論

克隆獲得GmHMADP，其cDNA全長(zhǎng)996 bp，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。GmHMADP蛋白定位于細(xì)胞核與細(xì)胞膜。GmHMADP的表達(dá)具有較高的組織特異性，在種子中表達(dá)量最高；同時(shí)，該基因的表達(dá)受高溫高濕和Cu、Cd脅迫的影響。GmHMADP能夠提高擬南芥的種子活力以及對(duì)Cu、Cd脅迫的耐性。