生脈飲調(diào)控糖尿病模型大鼠心肌脂質(zhì)代謝作用機(jī)制研究

石佳娜 葉佐武 徐金波 魯春芳 楊秀麗

作者單位：1浙江省人民醫(yī)院藥學(xué)部（杭州 310014）；2杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部（杭州 310014）；3浙江省立同德醫(yī)院藥學(xué)部（杭州310012）

糖尿病是胰島素抵抗和胰島素缺乏導(dǎo)致的以高血糖為主要特征的代謝紊亂綜合征，易引起心、腦、腎等并發(fā)癥。糖尿病狀態(tài)下血漿游離脂肪酸異常增高，心肌耗能增加，葡萄糖代謝下降，脂肪酸代謝增加，心臟內(nèi)過量的脂肪酸攝取和氧化導(dǎo)致心肌內(nèi)脂肪代謝產(chǎn)物的積聚，引起心臟脂質(zhì)毒性，并在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮功能紊亂、炎癥反應(yīng)增加，同時(shí)出現(xiàn)心肌的損傷，心肌的結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生改變[1-2]。項(xiàng)目組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生脈飲能改善糖尿病心肌脂質(zhì)代謝[3]，為更進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬采用Western blotting方法研究生脈飲改善鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)糖尿病模型大鼠心肌脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠72只，雄性，SPF級(jí)，6周齡，體質(zhì)量160～180g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥品與試劑 生脈飲（江西濟(jì)民藥業(yè)，批號(hào)130201，規(guī)格 10mL/支）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國sigma公司，批號(hào)031M1287V）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH（美國sigma公司，批號(hào)G5265）；磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）抗體（Cell Signaling Technology公司，批號(hào) 2532）；乙酰輔酶 A羧化酶（ACC）抗體（Abcam公司，批號(hào)ab45174）；羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG-CoA）抗體（Abcam公司，批號(hào)ab174830）；脂肪酸合成酶（FAS）抗體（Bioworld Technology公司，批號(hào)A0461）；核轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白（SREBP1）抗體（Abcam 公司，批號(hào) ab28481）；飲用水（杭州祥符水廠）。

1.3 儀 器 5810R離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Cobas c311血液生化儀，德國羅氏公司；蛋白質(zhì)電泳及電轉(zhuǎn)移裝置，北京六一儀器廠；臺(tái)式酶標(biāo)儀，Bio-Tek公司；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型制作 參照文獻(xiàn)[4]方法，建立糖尿病大鼠模型，大鼠腹腔注射35mg/kg STZ。繼續(xù)喂養(yǎng)1周后，測定空腹血糖，連續(xù)2次血糖≥l6.7mmol/L且有多飲、多食、多尿，表示造模成功。

2.2 分組與給藥 72只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、生脈飲預(yù)防組、生脈飲高、中、低劑量組六組，每組12只。對(duì)照組和模型組均給予飲用水12mL/kg灌胃，預(yù)防組造模前4周開始給予生脈飲12mL/kg灌胃，高、中、低劑量治療組在造模成功后分別給予12、6、3mL/kg生脈飲灌胃，預(yù)防組合計(jì)灌胃19周，其余各組均連續(xù)灌胃15周。造模與給藥期間，對(duì)照組給予普通飼料，其余各組均喂養(yǎng)高脂高熱量飼料。

2.3 心臟系數(shù)及生化指標(biāo)測定 各組給藥結(jié)束后，大鼠禁食10h，腹腔注射10%水合氯醛0.35g/kg麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置1h后分離血清，-20℃凍存待檢。自動(dòng)生化儀測定低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、載脂蛋白 A（ApoAⅠ）、載脂蛋白 B（ApoB）。處死大鼠后迅速取出心臟，用冷等滲鹽水洗凈，濾紙吸干，稱重并記錄，心臟系數(shù)=心臟質(zhì)量/動(dòng)物質(zhì)量；將心臟標(biāo)本編號(hào)后立即置入-80℃液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 Western blotting檢測心肌脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白將心肌組織剪碎、碾磨后，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，按步驟進(jìn)行蛋白提取和濃度測定，將樣本蛋白溶液分裝，使每分裝管中含有20～40μg的蛋白量，分裝后-80℃凍存?zhèn)溆?。取分裝好的蛋白樣本，補(bǔ)加三蒸水和 loading buffer（5×）至相同體積（一般為 10μL），煮沸5min使蛋白變性，上樣。跑膠用聚丙烯酰胺凝膠電泳（1×Running buffer電泳，先 70V，30min，待樣本跑至濃縮膠和分離膠交界處時(shí)，改為110V，90 min，直至溴酚藍(lán)跑至膠外）。進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育后，采用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測印跡膜，ECL試劑盒A液和B液按1:1比例混合，滴于干凈玻璃紙上，將膜用吸水紙吸干后正面向著AB混合液，孵育1 min，置于曝光盒中，在膜的位置上覆蓋上X光膠片，曝光后，取出膠片，放入膠片沖印機(jī)中，約3min后觀察結(jié)果。產(chǎn)物條帶用Gel Doc 2000型凝膠成像系統(tǒng)分析記錄結(jié)果。檢測磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路相關(guān)乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FAS）、核轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白（SREBP1）、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG-CoA）蛋白。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠心臟系數(shù)比較 模型組心臟系數(shù)高于對(duì)照組，生脈飲各劑量組心臟系數(shù)均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），且存在量效關(guān)系。見表1。

3.2 各組大鼠血脂比較 生脈飲預(yù)防組、高劑量組LDL低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。生脈飲預(yù)防組及各劑量組HDL高于對(duì)照組、模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。生脈飲預(yù)防組和各劑量組ApoAⅠ/ApoB均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表 2。

3.3 各組大鼠心肌磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路相關(guān)蛋白比較

3.3.1 各組大鼠心肌磷酸化（p）-AMPK蛋白比較Western blotting結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌磷酸化p-AMPK表達(dá)較對(duì)照組低（P＜0.05），而生脈飲預(yù)防組能上調(diào)p-AMPK的蛋白表達(dá)（P＜0.05）。見圖1。

3.3.2 各組大鼠心肌ACC、HMG-CoA蛋白比較Western blotting結(jié)果顯示，生脈飲干預(yù)能下調(diào)糖尿病模型大鼠心肌 ACC（P＜0.05）、HMG-CoA（P＞0.05）蛋白表達(dá)。見圖 2、3。

3.3.3 各組大鼠心肌FAS、SREBP1蛋白比較 Westen blotting結(jié)果顯示，生脈飲干預(yù)能下調(diào)糖尿病模型大鼠心肌 FAS（P＜0.05）、SREBP1（P＞0.05）蛋白的表達(dá)。見圖 4、5。

表1 各組大鼠心臟系數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠心臟系數(shù)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，△△P＜0.01，與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別對(duì)照組模型組生脈飲預(yù)防組生脈飲高劑量組生脈飲中劑量組生脈飲低劑量組鼠數(shù)12 12 12 12 12 12心臟系數(shù)（×100）0.2512±0.0196 0.3589±0.0164△△0.3236±0.0075**0.3274±0.0016**0.3328±0.0146**0.3400±0.0009*

圖1 生脈飲對(duì)糖尿病模型大鼠心肌p-AMPK蛋白的影響

4 討論

表2 各組大鼠血脂比較（±s）

表2 各組大鼠血脂比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；LDL：低密度脂蛋白；HDL：高密度脂蛋白；TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；ApoAⅠ：載脂蛋白A；ApoB：載脂蛋白B

組別對(duì)照組模型組生脈飲預(yù)防組生脈飲高劑量組生脈飲中劑量組生脈飲低劑量組鼠數(shù)12 12 12 12 12 12 TG（mmol/L）1.53±0.63 3.26±2.22#3.35±1.98 3.44±1.74 2.28±1.43 3.19±1.36 TC（mmol/L）2.06±0.51 2.34±0.34 2.42±0.57 2.59±0.59 2.30±0.74 2.90±0.56 HDL（mmol/L）1.55±0.24 1.65±0.41 2.12±0.27**△△2.09±0.34*△2.21±0.32**△△2.48±0.34**△△LDL（mmol/L）0.25±0.096 0.42±0.14△△0.28±0.14*0.25±0.10*0.30±0.16 0.36±0.16 ApoAⅠ/ApoB 1.014±0.450 0.588±0.242△0.917±0.204*2.000±0.577**1.278±0.565**1.333±0.500**

《傷寒論》記載：“消渴，氣上撞心，心中痛熱”，“消渴病心積”。消渴病病久入絡(luò)，損傷心絡(luò)，導(dǎo)致陰陽氣血虧虛，臟腑功能失調(diào)；中醫(yī)認(rèn)為，陰虛為消渴致病之本，兼夾濕熱、燥熱、瘀熱等為病之標(biāo)；益氣養(yǎng)陰，化瘀通絡(luò)為主要治法之一。生脈飲由黨參、麥冬、五味子組成，具有益氣復(fù)脈、養(yǎng)陰生津的功能；用于氣陰兩虧，心悸氣短，脈微自汗。研究發(fā)現(xiàn)[5-7]生脈膠囊可改善慢性心衰心室重構(gòu)，生脈注射液可提高糖尿病大鼠的血管內(nèi)皮功能，改善心功能。

圖2 生脈飲對(duì)糖尿病模型大鼠心肌ACC蛋白的影響

圖3 生脈飲對(duì)糖尿病模型大鼠心肌HMG-CoA蛋白的影響

圖4 生脈飲對(duì)糖尿病模型大鼠心肌FAS蛋白的影響

圖5 生脈飲對(duì)糖尿病模型大鼠心肌SREBP1蛋白的影響

研究[8]發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者心肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平是健康人的5～6倍。糖尿病狀態(tài)下，由于胰島素抵抗，心肌細(xì)胞中葡萄糖底物減少且脂肪酸水平增高，對(duì)脂肪細(xì)胞抑制減弱，脂肪酸的攝取超過了氧化的速度，導(dǎo)致脂質(zhì)在心肌細(xì)胞內(nèi)堆積[9-10]。研究[11-12]表明，AMPK激活（磷酸化）后才能增強(qiáng)組織對(duì)葡萄糖的攝取、脂肪酸的氧化及胰島素敏感性，并可減少葡萄糖的輸出及異生，減少膽固醇和甘油三酯的生成。AMPK在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中起著重要作用：（1）抑制脂肪酸及膽固醇的合成。ACC和HMG-CoA是AMPK的兩個(gè)靶蛋白，分別是脂肪酸和膽固醇合成過程中的關(guān)鍵酶。活化的AMPK可使其磷酸化，抑制其功能，從而對(duì)抑制肝脂肪酸和膽固醇的合成起關(guān)鍵作用。（2）增加脂肪酸氧化。激活的AMPK可以通過磷酸化作用抑制ACC，減少丙二酰輔酶A的合成，導(dǎo)致脂肪酸的氧化增強(qiáng)。（3）抑制脂解作用[11]。（4）AMPK激活后可通過抑制SREBP1而抑制FAS的活性，從而抑制脂肪酸的合成[12]。

本實(shí)驗(yàn)顯示，生脈飲可能通過磷酸化激活A(yù)MPK，通過調(diào)節(jié) AMPK 下游 ACC、SREBP、HMG-CoA、FAS等蛋白，從而改善糖尿病大鼠的脂質(zhì)代謝。表明生脈飲改善STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠心肌脂質(zhì)代謝作用可能與AMPK有關(guān)。但由于中藥化學(xué)成分多且復(fù)雜，作用機(jī)制復(fù)雜，量效關(guān)系難以控制，本論文研究結(jié)果僅可為生脈飲改善糖尿病心肌脂質(zhì)代謝提供思路和方法，為AMPK相關(guān)機(jī)制的進(jìn)一步明確提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。