烏司他丁對(duì)呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎模型大鼠腸道通透性及細(xì)菌移位的影響

王瑞明

作者單位：杭州市中醫(yī)院急診科（杭州 310007）

腸道是人體最大的細(xì)菌庫[1]，腸道黏膜是抵御細(xì)菌入侵的重要屏障且極易受損傷。危重患者由于缺氧、感染、應(yīng)激等各種刺激使腸道屏障改變，通透性增高，腸道免疫功能抑制，腸內(nèi)細(xì)菌和毒素移位，參與多器官功能障礙綜合癥（MODS）的發(fā)病。研究[2]表明，谷氨酰胺是腸道黏膜的重要能源物質(zhì)，有保持腸黏膜完整性的作用。烏司他丁可以有效抑制炎癥介質(zhì)釋放，保護(hù)重要臟器。本研究就烏司他丁及谷氨酰胺對(duì)呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎（VAP）大鼠腸黏膜屏障及細(xì)菌移位進(jìn)行探討。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量280～320g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房提供，合格證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 光學(xué)顯微鏡（Olympus日本），石蠟切片機(jī)（RM2135型 德國），低溫高速離心機(jī)（Beckman德國），SX-300S凝膠圖像分析處理系統(tǒng)（上海小源科技有限公司），高效液相色譜儀（美國water公司），精密電子天平（Sartorius公司），電泳儀（Bio-RAD公司），代謝籠等。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 烏司他?。◤V東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)H20040476）、谷氨酰胺（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)H20053877）、乳果糖標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)6300817E7）和甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)S11049）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎（VAP）模型建立[3]（1）經(jīng)口氣管插管：用16和18號(hào)靜脈套管針制備氣管導(dǎo)管。大鼠麻醉前禁食12h，用20%的烏拉坦腹腔注射麻醉，用消毒小紗布將舌向左外側(cè)上方輕輕拉出，頭部盡量向上抬起，同時(shí)上下頜分開。在額戴式喉鏡反射光照射下對(duì)準(zhǔn)聲門旋轉(zhuǎn)插入自制氣管導(dǎo)管，插入深度為套管針尾部與牙齒平齊。觀察棉絮在氣管導(dǎo)管口的起伏并用聽診器聽雙肺呼吸音以確定導(dǎo)管在氣管內(nèi)，將氣管導(dǎo)管外層與大鼠上唇縫合固定，連接動(dòng)物呼吸機(jī)控制呼吸。呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)定為：潮氣量（V）12mL/kg，呼吸頻率 70 次/min，吸入氧濃度（FiO2）100%。為防止體位引起的肺不張，每隔30min行2～3次大V通氣。股靜脈插管，以3～5mL/h輸入5%的葡萄糖鹽水。（2）大鼠VAP模型制備：每只大鼠機(jī)械通氣24h（無需使用肌松劑）后，豎起固定板＞45度，以微量注射器快速注入0.2mL 3×108cfu/L銅綠假單胞菌（PA）菌液和0.55mL氣體，并保持體位5min。造模成功標(biāo)準(zhǔn)[3]：出現(xiàn)肺炎臨床表現(xiàn)；肉眼觀察大鼠肺葉可見不同程度的融合性出血性病灶；光鏡下觀察大鼠肺組織呈小葉性肺炎特征；外周血和肺泡灌洗液（BALF）細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)陽性。

2.2 給藥方法 將100只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析及Dunnett’s法進(jìn)行兩兩比較。計(jì)量資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠腸道通透性（尿液L/M）比較 術(shù)后第5天24h尿液L/M五組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19.41，P＜0.01）。進(jìn)一步兩兩比較，模型組 L/M 高于空白對(duì)照組（P＜0.01），其余三組則與空白對(duì)照組相似，但均低于模型組（P均＜0.01），見表1。照組、模型組、烏司他丁組、谷氨酰胺組、烏司他丁聯(lián)合谷氨酰胺組，每組20只。除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠均建立VAP模型，模型組、空白對(duì)照組大鼠予生理鹽水靜脈注射2mL/d。其余各組分別給予烏司他丁10萬U/kg靜脈注射2mL/d、谷氨酰胺0.75g/kg靜脈注射2mL/d、烏司他丁加谷氨酰胺（劑量同上），連續(xù)給藥5天。

2.3 檢測(cè)項(xiàng)目 （1）腸道通透性：給藥后第5天，各組大鼠經(jīng)口灌胃乳果糖+甘露醇混合液2mL，轉(zhuǎn)代謝籠收集24h尿液。取10mL尿液加硫柳汞2mL置 -20℃冰箱保存。用HS色譜工作站對(duì)色譜圖形進(jìn)行積分處理。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算公式算出標(biāo)本中甘露醇及乳果糖濃度，從而計(jì)算得出乳果糖/甘露醇腸道通透性（L/M）。（2）腸系膜淋巴結(jié)培養(yǎng)：給藥后第6天處死大鼠，在無菌條件下取數(shù)枚腸系膜根部淋巴結(jié)，經(jīng)碾磨后置37℃培養(yǎng)箱孵育48h后鑒定菌種及統(tǒng)計(jì)菌落計(jì)數(shù)。菌落數(shù)超過100/g組織為細(xì)菌移位陽性。

表1 各組大鼠腸道通透性（尿液L/M）比較（±s）

表1 各組大鼠腸道通透性（尿液L/M）比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.01；L/M：乳果糖/甘露醇

組別空白對(duì)照組模型組烏司他丁組谷氨酰胺組烏司他丁聯(lián)合谷氨酰胺組鼠數(shù)20 20 20 20 20 L/M 0.1592±0.0621 0.4496±0.1880△0.2622±0.0965*0.2490±0.0846*0.2193±0.0745*

3.2 各組大鼠細(xì)菌培養(yǎng)陽性率比較 模型組陽性率明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.01），其余三組均低于模型組（P均＜0.01）。培養(yǎng)結(jié)果主要為大腸桿菌為主的腸道寄生菌細(xì)菌，見表2、圖1（插頁）。

4 討論

呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎（VAP）是指應(yīng)用機(jī)械通氣治療后48h和停用機(jī)械通氣拔除人工氣道48h內(nèi)發(fā)生的肺實(shí)質(zhì)的感染性炎癥。呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的病因和發(fā)病機(jī)制較多，其中呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎與腸道功能關(guān)系非常密切。腸道是機(jī)體最大細(xì)菌和毒素庫，由于禁食等多種原因?qū)е履c道菌群失調(diào)，屏障功能破壞，有可能成為VAP患者菌血癥來源。腸道菌群的移位及腸黏膜的屏障作用與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎關(guān)系密切。

表2 各組大鼠細(xì)菌培養(yǎng)陽性率比較（%）

腸黏膜通透性增高是腸屏障功能受損的重要表現(xiàn)[4]，黏膜通透性增高出現(xiàn)在腸黏膜形態(tài)學(xué)出現(xiàn)改變之前。因此，通過檢測(cè)腸黏膜通透性可以反映腸黏膜屏障功能，尿L/M比值可以有效反映腸道通透性的改變[5]。谷氨酰胺作為人體內(nèi)重要的自由氨基酸之一，在維持腸道完整性和維持人體多種生理代謝方面起著重要的作用[6-7]。谷氨酰胺對(duì)危重患者的腸道保護(hù)作用已初步得到肯定[8]，它可以減輕腸屏障損害，防止腸源性感染[9-10]，抑制小腸黏膜萎縮[11]。烏司他丁具有很強(qiáng)的水解酶抑制作用，有抑制炎癥介質(zhì)的釋放作用[12]。本研究顯示，腸道通透性方面，與空白對(duì)照組比較，模型組L/M明顯增大（P＜0.01），其余三組則與空白對(duì)照組相似，谷氨酰胺組L/M小于烏司他丁組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。細(xì)菌移位方面，模型組陽性率明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.01），其余三組低于模型組（P＜0.01），培養(yǎng)結(jié)果主要為大腸桿菌為主的腸道寄生菌。烏司他丁及谷氨酰胺對(duì)VAP腸道黏膜的通透性及防止腸道菌群移位有一定的作用。