啤酒高濃釀造中氨基酸對酵母發(fā)酵性能和啤酒色值的影響

任 璐，王瑩鈺，楊 沫，蔡天嬌，雷宏杰*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

啤酒高濃釀造技術(shù)主要應(yīng)用于低濃度啤酒和高輔料啤酒的生產(chǎn)，現(xiàn)已成為一項成熟的工藝并被廣泛應(yīng)用于淡爽型啤酒釀造中[1]。國內(nèi)外知名啤酒釀造企業(yè)如青島啤酒、百威啤酒等都已成功運用了啤酒高濃釀造技術(shù)，并充分發(fā)揮了該技術(shù)所帶來的優(yōu)勢：在投資和運行成本較低的情況下，增加產(chǎn)量50%～100%[2-3]。然而，麥汁濃度過高會帶來很多生產(chǎn)上的問題，如發(fā)酵時間的延長、麥汁發(fā)酵度和酵母絮凝性的降低[4-5]、啤酒風(fēng)味和泡沫穩(wěn)定性變差等[6-7]，主要原因是高濃麥汁導(dǎo)致酵母細胞需要承受更大的環(huán)境脅迫，如高滲透壓和高乙醇毒性，均對酵母細胞產(chǎn)生一定的毒害作用[8]。而且，發(fā)酵后期營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，尤其是溶氧水平和可同化氮源的降低，致使環(huán)境脅迫作用更加嚴(yán)重[9-10]。

氮源作為酵母細胞生長和代謝所必需的元素之一，在酵母生長、繁殖過程中扮演著非常重要的角色。維持較高水平的游離氨基氮（free amino nitrogen，F(xiàn)AN）可改善酵母細胞的生長率和發(fā)酵度[11]，而麥汁濃度的升高可導(dǎo)致細胞對氨基酸的吸收速率下降[12-13]。氨基酸作為重要的可同化氮源不僅參與細胞內(nèi)各物質(zhì)的代謝[13]，并能提高啤酒非生物穩(wěn)定性，而且部分氨基酸還可調(diào)控啤酒酵母細胞適應(yīng)高滲透壓和高乙醇毒性，從而提高酵母的發(fā)酵性能。對于能夠改善啤酒酵母發(fā)酵性能的關(guān)鍵氨基酸的確定還存在較大爭論，相關(guān)研究也甚少。Lekkas等[14]認為Lys和Met是啤酒釀造過程中的關(guān)鍵氨基酸，可提高酵母的發(fā)酵性能，而Mas等[15]的研究結(jié)果表明Met抑制了酵母細胞的生長；Lei Hongjie等[16]發(fā)現(xiàn)Lys和His能夠促進酵母細胞生長、提高麥汁發(fā)酵度和乙醇產(chǎn)量。這些矛盾的研究結(jié)果可能是由發(fā)酵條件的差異和酵母菌種特異性引起的。

本研究的前期工作表明：在不同的環(huán)境脅迫條件下（高滲透壓和高乙醇毒性），酵母對8種氨基酸（Met、Phe、Trp、Arg、His、Ile、Leu、Lys）的同化與發(fā)酵性能（麥汁發(fā)酵度和乙醇產(chǎn)量）之間呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性（P＜0.05），表明這8 種氨基酸可能有助于啤酒酵母適應(yīng)高濃釀造過程中的環(huán)境脅迫。因此，本研究目的是驗證這8 種氨基酸在啤酒高濃釀造中對酵母發(fā)酵性能的改善作用，為啤酒高濃釀造中優(yōu)質(zhì)氮源的選擇提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與原料

Lager啤酒酵母Saccharomyces pastorianus，由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品工程實驗室提供。該菌種經(jīng)紫外照射和甲基磺酸乙酯復(fù)合誘變后在含有高濃度麥芽糖和乙醇的培養(yǎng)基上進行馴化培養(yǎng)獲得。

澳麥芽 廈門市老啤匠貿(mào)易有限公司；酒花顆粒西安雪花啤酒有限公司。

1.1.2 試劑

果糖 厚樸生物科技（蘇州）有限公司；亞甲基藍 南京化學(xué)試劑股份有限公司；無水乙醇、氯化鈉、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYJX型-80 ℃冰箱 鼎耀機械有限公司；UV1780紫外-可見分光光度計 日本島津公司；TS-1102C小型立式恒溫振蕩箱 上海天呈實驗儀器制有限公司；XP6電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；860型粉碎機 南京威利朗是食品機械有限公司；E100LED MV生物顯微鏡 日本尼康公司；BSD-150搖床培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司；ATAGO糖度計廈門森態(tài)儀器儀表有限公司；YX-280高壓滅菌鍋江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；CM-5色差計 科電貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 麥汁制備

稱取一定量的澳麥芽，經(jīng)粉碎機粉碎后裝入糖化鍋內(nèi)，按照麥芽與水的質(zhì)量比為1∶4加入45 ℃釀造水，攪拌均勻，用乳酸調(diào)至pH 5.5。設(shè)置升溫程序依次為：45 ℃，30 min；63 ℃，60 min；72 ℃，10 min；78 ℃，10 min。以1 ℃/min的速率升溫，開始糖化，糖化結(jié)束后迅速冷卻至45 ℃進行濾布過濾，再將濾液煮沸90 min，煮沸過程中分3 次添加酒花顆粒，添加量為麥芽質(zhì)量的0.2%。煮沸結(jié)束后再次用紗布過濾，得到澄清麥汁。將澄清的麥汁用釀造水定型至12 °P，然后添加麥芽糖漿提高麥汁濃度至24 °P。發(fā)酵前進行121 ℃、15 min高壓蒸汽滅菌。

1.3.2 酵母種子擴培和啤酒發(fā)酵

在無菌條件下，用接種環(huán)從試管斜面上刮取一環(huán)酵母，接種于10 mL 12 °P全麥芽麥汁種子培養(yǎng)液中，25 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，之后轉(zhuǎn)入200 mL 12 °P全麥芽麥汁種子液中，20 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)48 h，最后轉(zhuǎn)入1 L種子液中，15 ℃靜置培養(yǎng)72 h。8 000×g、4 ℃離心10 min取酵母泥，接種量5×106個細胞/mL。

采用2 L錐形瓶進行啤酒發(fā)酵，裝液量為1.0 L的24 °P無菌麥汁，接種酵母之前在發(fā)酵錐形瓶中添加8 種氨基酸混和物（Met、Phe、Trp、Arg、His、Ile、Leu、Lys），氨基酸的比例按照常濃12 °P麥汁中的相應(yīng)氨基酸比例計算（Met 79 mg/L、Phe 300 mg/L、Trp 148 mg/L、Arg 381 mg/L、His 209 mg/L、Ile 183 mg/L、Leu 412 mg/L、Lys 192 mg/L），對照組中未添加氨基酸，在其他實驗組中氨基酸混合物的添加量分別是原麥汁這8 種氨基酸混合物（12 °P全麥芽麥汁）的0.5、1、2 倍。發(fā)酵溫度為15 ℃。每天定時取樣，發(fā)酵液和酵母菌體經(jīng)8 000×g、4 ℃離心15 min，將上清液置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 酵母細胞計數(shù)和活細胞率測定

采用血球計數(shù)板計數(shù)法測定懸浮酵母細胞數(shù)量和活細胞率（亞甲基藍染色）。將從錐形瓶中取出的樣液稀釋10 倍后測定其懸浮細胞數(shù)和活細胞率。在0.1 mL細胞懸浮液中加入0.9 mL磷酸鹽亞甲基藍溶液（pH 4.6），振蕩混勻，10 min后在電子顯微鏡下通過血球計數(shù)板對活細胞和死細胞（死亡的細胞被染成了藍色）進行計數(shù)。

1.3.4 麥汁濃度和乙醇體積分數(shù)測定

將發(fā)酵后的麥汁8 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液30 mL，倒入25 mL的附溫比重瓶中，將附溫比重瓶置于20 ℃水浴中，待溫度升到20 ℃，快速取出，稱其質(zhì)量，測定其在20 ℃條件下的浸出物含量。麥汁濃度用°P表示，即100 mL麥汁中含有浸出物的固形物質(zhì)量（g）。

將發(fā)酵后的麥汁離心取上清液50 mL，倒入500 mL蒸餾瓶中，再加入50 mL去離子水，加熱蒸餾。用50 mL的容量瓶收集餾出液，當(dāng)餾出液體積接近50 mL時，停止蒸餾，用蒸餾水定容至50 mL。用附溫比重瓶測定其在20 ℃條件下的乙醇體積分數(shù)。

1.3.5 麥汁FAN測定

對麥汁中的FAN水平測定采用茚三酮顯色法[17]。制備Gly標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、80、100、120、140、160 μmol/L），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。麥汁樣品稀釋100 倍，首先在具塞玻璃試管中加入2.0 mL的稀釋樣品，然后加入1.0 mL的顯色劑（0.5 g茚三酮、10.0 g Na2HPO4·12H2O、6.0 g KH2PO4和0.3 g果糖溶于100 mL去離子水，pH 6.7）；再將試管放進100 ℃沸水浴中，使其精確反應(yīng)16 min，然后20 ℃恒溫水浴下冷卻20 min，待冷卻完成后加入5.0 mL的稀釋劑（2.0 g KIO3溶于1 L的40%乙醇溶液），用旋渦振蕩器混勻，靜置15 min；最后在波長570 nm條件下檢測樣品吸光度。計算公式如式（1）所示：

1.3.6 啤酒色值測定

首先制備待測樣品，將發(fā)酵后的啤酒樣品稀釋至青島純生啤酒的乙醇體積分數(shù)，再將色差儀經(jīng)黑板和蒸餾水矯正后，置待測樣品于透明比色皿中進行檢測，獲得L*、a*、b*值，經(jīng)式（2）計算得到與成品啤酒的色差ΔE。

1.3.7 麥汁發(fā)酵度的計算

麥汁發(fā)酵度是啤酒發(fā)酵過程中麥汁固形物被酵母消耗的百分數(shù)。計算如式（3）所示：

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個數(shù)據(jù)均為3 次測定的平均值，采用Minitab 16進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以 ±s表示，多重比較采用Tukey法，顯著水平P值小于0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氨基酸添加倍數(shù)對啤酒高濃釀造過程中酵母生長的影響

圖1 24 °P高濃條件下對照組麥汁與添加氨基酸麥汁發(fā)酵過程中的懸浮酵母細胞數(shù)（A）和活細胞率（B）Fig.1 Number of suspended yeast cells (A) and cell viability (B) in the control group and malt wort with addition of amino acids during 24 °P high gravity fermentation

由圖1A可知，在發(fā)酵前2 d，懸浮酵母數(shù)快速增多，與對照組相比，添加氨基酸的高濃麥汁中懸浮酵母細胞數(shù)增加顯著。在發(fā)酵的第2天懸浮細胞數(shù)達到最多，對照組與添加0.5、1、2 倍氨基酸實驗組中的懸浮酵母凈生長量分別是1.73×107、2.90×107、3.23×107、2.40×107個/mL，結(jié)果表明，氨基酸的添加顯著提高了酵母的凈生長量，削弱了發(fā)酵初期高滲透壓對酵母生長的抑制作用。這是因為氨基酸可調(diào)控酵母細胞適應(yīng)高滲透壓環(huán)境，并刺激了細胞的繁殖。而且在發(fā)酵初期階段（前3 d），添加1 倍氨基酸的高濃麥汁中懸浮酵母細胞數(shù)保持最多，可見氮源濃度過低和過高都不利于酵母細胞的生長繁殖，這是因為低氮源水平會降低酵母生長速率并影響細胞繁殖[18]，而高濃度氮源則激活了酵母胞內(nèi)的氮分解代謝物阻遏效應(yīng)，不利于酵母對氮源的同化[19-21]，從而影響酵母的生長繁殖。酵母絮凝性是啤酒酵母的一個重要特性，在生產(chǎn)過程中絮凝性的強弱不僅可控制啤酒的發(fā)酵周期、過濾性能等，而且會對啤酒的風(fēng)味產(chǎn)生影響[22]。主發(fā)酵溫度一定時，原麥汁濃度對酵母絮凝性影響較大，原麥汁濃度越高，酵母絮凝性越低[4]。氮源水平對發(fā)酵后期酵母的絮凝性能影響也較大，與對照組相比，氨基酸的添加可引起細胞絮凝性有所降低。氨基酸的添加對發(fā)酵末期酵母活細胞率也產(chǎn)生了顯著的影響（圖1B），在發(fā)酵第6天后，對照組高濃麥汁中活細胞率快速降低，而添加氨基酸的高濃麥汁中活細胞率下降較為平緩。在發(fā)酵結(jié)束時，對照組的活細胞率較低（≤86%），而添加氨基酸的實驗組活細胞率仍保持較高（≥91%）?？梢姡? 種氨基酸可調(diào)控酵母細胞適應(yīng)高滲透壓和高乙醇毒性環(huán)境，保證了酵母細胞在高濃釀造過程中具有較高的細胞活力。

2.2 不同氨基酸添加倍數(shù)對麥汁發(fā)酵度的影響

在氮缺乏的情況下，細胞中的蛋白質(zhì)及ATP含量較低，對釀酒酵母的發(fā)酵能力產(chǎn)生抑制作用，而氮源的添加可顯著加快發(fā)酵速率，改善酵母發(fā)酵能力，增加CO2釋放量[19]。如圖2所示，與對照組的發(fā)酵度相比（80%），添加0.5、1、2 倍氨基酸均可顯著提高麥汁發(fā)酵度，分別為84%、85%和82%（P＜0.05）。導(dǎo)致對照組麥汁發(fā)酵度較低的原因為低氮源水平抑制了酵母細胞生長及發(fā)酵性能[23]；添加0.5 倍和1 倍氨基酸的麥汁發(fā)酵度之間沒有顯著性差異（P＞0.05），而添加2 倍氨基酸的麥汁發(fā)酵度顯著降低（P＜0.05），這是因為高濃度氮源導(dǎo)致了酵母細胞內(nèi)氮代謝物阻遏效應(yīng)的發(fā)生，影響了細胞對氮源的吸收和利用[24-27]，從而降低了酵母的發(fā)酵性能。

圖2 24 °P高濃條件下對照組麥汁與添加氨基酸組麥汁的發(fā)酵度Fig.2 Fermentability of the control group and malt wort with addition of amino acids under 24 °P high gravity

2.3 不同氨基酸添加倍數(shù)對乙醇產(chǎn)量的影響

乙醇產(chǎn)量是描述發(fā)酵程度的一個重要指標(biāo)，在相同濃度麥汁的發(fā)酵體系中，F(xiàn)AN水平的提高可提高麥汁發(fā)酵度，發(fā)酵度與乙醇產(chǎn)量成正比[28]。如圖3所示，高濃麥汁中氨基酸的補充可顯著增加乙醇產(chǎn)量（P＜0.05），且添加1 倍氨基酸的麥汁發(fā)酵得到乙醇產(chǎn)量最多，為13.56%；與對照組相比，添加0.5、1、2 倍氨基酸的麥汁發(fā)酵最終乙醇產(chǎn)量分別提高了13%、17%、12%，表明氨基酸的補充可有效改善酵母的代謝，提高細胞的乙醇耐受性。啤酒高濃釀造中，高氮源水平導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量下降的原因可能是氮源過高會造成酵母菌生長過于旺盛，過多的糖被用于細胞的增殖，反而不利于乙醇的積累[26]，另一方面高濃度氮源會影響氮代謝途徑，反而削弱了酵母對氮的吸收，降低了乙醇產(chǎn)量[19-21]。

圖3 24 °P高濃條件下對照組麥汁與添加氨基酸麥汁的乙醇產(chǎn)量Fig.3 Ethanol production of the control group and malt wort with addition of amino acids under 24 °P high gravity

2.4 不同氨基酸添加倍數(shù)對FAN消耗的影響

圖4 24 °P高濃條件下對照組麥汁與添加氨基酸麥汁中的FAN消耗Fig.4 Free amino nitrogen (FAN) consumption of the control group and malt wort with addition of amino acids under 24 °P high gravity

由圖4可知，麥汁中添加氨基酸顯著增加了酵母對FAN的消耗，可見麥汁中氮源的缺乏是造成高濃釀造發(fā)酵度降低的主要原因。對照組和添加0.5、1、2 倍氨基酸組麥汁發(fā)酵中總的FAN消耗量分別為448、551、637、514 mg/L，具有顯著差異（P＜0.05）。其與細胞生長速率和麥汁發(fā)酵度之間有顯著的正相關(guān)性[29]。添加1 倍氨基酸的麥汁發(fā)酵過程中酵母對FAN的消耗量最多，從而顯著提高了麥汁發(fā)酵度和乙醇產(chǎn)量。

2.5 不同氨基酸添加倍數(shù)對啤酒色值的影響

一般常用European Brewery Convention（EBC）比色計法表示啤酒的色度，此方法必須通過肉眼觀察色片與啤酒的顏色，這對操作者對顏色的觀察能力和敏感程度有較高的要求，由于操作人員之間對顏色的敏感程度不同，結(jié)果必然存在差異[30]。本實驗通過色差儀測定樣品的L*、a*、b*值，不僅可準(zhǔn)確定位到一個三維立體點上的色值，不受人感官的局限，還可通過色差ΔE進行對照樣品與被測樣品之間的比較。

表1 稀釋至正常飲用啤酒乙醇體積分數(shù)后的啤酒色值Table1 Beer color values after dilution to normal alcohol for consumption

在本實驗中，高濃釀造啤酒經(jīng)釀造水稀釋至市售啤酒乙醇體積分數(shù)后，與商品啤酒中較暢銷的青島純生啤酒相比較（表1），添加氨基酸高濃釀造稀釋后的啤酒色澤依然鮮亮，與青島純生啤酒相比，L*值無顯著性差異（P＞0.05），a*值差異顯著（P＜0.05）；而未添加氨基酸高濃釀造稀釋后的啤酒與青島純生啤酒相比，L*、a*、b*分別差異顯著（P＜0.05）。這可能與多酚類物質(zhì)氧化、酵母對氨基酸代謝等有關(guān)[31]。添加1 倍氨基酸釀造而成的啤酒經(jīng)稀釋后ΔE最小，說明其與對照組青島純生啤酒的色澤差異最小。

3 結(jié) 論

啤酒高濃釀造中8 種氨基酸的補充可顯著提高麥汁發(fā)酵度和乙醇產(chǎn)量，促進酵母生長并維持酵母活細胞率，且8 種氨基酸混合物的最適添加量為1 倍。與對照組相比，添加1 倍氨基酸混合物的高濃麥汁發(fā)酵中，發(fā)酵度提高了6%，乙醇產(chǎn)量提高了17%。添加氨基酸混合物的高濃麥汁發(fā)酵而成的啤酒稀釋至乙醇體積分數(shù)與青島純生啤酒一致時，啤酒的色澤依然鮮亮，其中添加1 倍氨基酸高濃釀造而成的啤酒經(jīng)稀釋后ΔE最小，色澤最接近青島純生啤酒。本研究為啤酒高濃釀造工業(yè)化生產(chǎn)中優(yōu)質(zhì)氮源的選擇提供理論依據(jù)和方法指導(dǎo)。8 種氨基酸分別對啤酒酵母發(fā)酵性能的影響，以及8 種氨基酸之間的相互作用將成為下一步的重點研究內(nèi)容。