大鼠坐骨神經損傷后局部自噬激活的動態(tài)變化

馮揚 賴重媛 陳靜燕 古力切木·艾麥爾 廖松潔

神經病理性疼痛(NP)是由體感神經系統(tǒng)疾病或病理損傷所直接導致的疼痛，在全球范圍內的患病率是6.9%～10.0%[1-2]。NP對患者的身心健康產生不容忽視的不良影響[3]。由于NP的發(fā)生機制未知領域眾多，導致目前臨床療效尚不理想。因此，對參與NP發(fā)生機制的更深入研究極具臨床和科研價值。自噬是細胞內降解長壽蛋白與細胞器的一條主要通路，是近年來的研究熱點，在神經病學領域，自噬與帕金森病、老年癡呆、肌肉病及腦血管疾病密切相關，而在以NP為表現(xiàn)的有關周圍神經病的研究中，自噬也成為了新的研究方向[4-8]。最近研究顯示在不同的NP模型中，脊髓的自噬改變雖然不完全相同，但抑制自噬后大鼠疼痛加重，提示增強自噬可以成為治療NP的新方向[9]。不少文獻報道NP中脊髓背角不同神經細胞自噬水平的改變可能參與其發(fā)生與發(fā)展[10-12]。而在經典的周圍神經病理性疼痛模型即坐骨神經壓迫模型(CCI)中，以坐骨神經探討自噬的相關改變較少，筆者見目前國內文獻尚無報道。因此，為了提高對NP中坐骨神經自噬發(fā)生的認識，筆者觀察了大鼠慢性神經壓迫后坐骨神經自噬水平的表達，并進一步觀察坐骨神經內不同神經細胞的自噬形態(tài)。

材料與方法

一、實驗動物

采用36只體質量250～280 g、8周齡的成年雄性Sprague-Dawley大鼠(廣東省醫(yī)學動物中心，許可證號：SCXK粵2013-0011)作為實驗動物。大鼠置于SPF級動物房中飼養(yǎng)，12 h光照，自由飲水進食，本研究中的實驗動物均按照中山大學實驗動物福利和倫理規(guī)范進行飼養(yǎng)和實驗。

二、材 料

小動物手術器械購于深圳市瑞沃德生命科技有限公司；觸覺測量套件購于Ugo Basile中國分公司；生理鹽水、電鏡固定液購于中山大學附屬第一醫(yī)院；dylight 488標記的山羊抗兔二抗免疫球蛋白G(1∶800，Jackson Immuno Reseach公司)；兔抗大鼠LC3抗體(1∶1 000，CST公司)；兔抗大鼠P62抗體(1∶500，CST公司)；HRP標記抗兔IgG二抗(1∶2 000，CST公司)。

三、方 法

1.動物分組

采用隨機數(shù)字表法將36只大鼠分為假手術組(Sham組)和坐骨神經結扎組(CCI組)各18只。術前1 d測定2組大鼠的足底基礎痛閾值，術后1、4、7 d再次評定。術后4 d或7 d處死大鼠，2組每個時間點各9只大鼠，其中3只取坐骨神經組織行蛋白免疫印跡檢測自噬特異蛋白微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、P62蛋白的表達，3只冰凍切片后行免疫熒光檢測LC3，余下3只行透射電鏡觀察坐骨神經的自噬狀態(tài)。

2.模型制備

根據Bennet等[13]的研究制作CCI模型，在無菌條件下進行操作，以10%水合氯醛(300～400 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，將大鼠置于俯臥位固定，從右側大腿中部作1 cm長切口，沿股二頭肌方向鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經主干。用3根3-0絲線(先用生理鹽水浸泡)間隔約1 mm結扎，使神經的直徑縮窄1/3，結扎力道以引起小腿肌肉輕微顫動反應為宜，逐層縫合手術切口。Sham組大鼠則切開右后肢皮膚，分離肌肉，暴露坐骨神經后立即縫合，僅暴露不結扎。

3.疼痛行為學測試

以大鼠機械性縮足反射閾值(MWT)評價疼痛，通過Chaplan等[14]的Up-down法于術前1 d測定MWT，術后第1、4、7日再次評定。該方法如下：將大鼠置于帶有金屬網底板的有機玻璃盒中，待大鼠較安靜時，采用8根強度呈對數(shù)遞增方式的Von Frey纖維絲，緩慢垂直刺向其右側后足掌部，避開爪墊，使Von Frey絲發(fā)生彎曲并持續(xù)6～8 s。若大鼠在測試時或移開纖維絲時立刻出現(xiàn)快速的撤足反應，則記為陽性，若無反應，則為陰性。以2.0 g為初始刺激強度，若出現(xiàn)陰性反應給予相鄰大一級的力度刺激；若出現(xiàn)陽性反應，則給予相鄰小一級的力度刺激，如此反復，以第一個轉折點的前一個點為起點，再向下連續(xù)測定5次，刺激結果為最終的撤足反應模式。根據Chaplan等[14]的計算方法，通過特定的程序將撤足反應模式轉換為相應的撤足閾值(單位：m/g)。

4.坐骨神經組織準備

術后第4日和第7日，取Sham組及CCI組各9只大鼠，予腹腔麻醉后，將其中3只大鼠左心室灌注4 ℃生理鹽水，快速取出術側坐骨神經，置于預冷的1.5 ml 離心管中，立即投入液氮中急凍，隨后取出放于超低溫冰箱備用。再將3只大鼠的左心室行4%多聚甲醛灌注固定，快速取出術側坐骨神經(結扎處遠近段約5 mm)，固定6 h，再浸泡于20%、30%蔗糖溶液于4 ℃梯度脫水，待組織沉底后，使用聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物(OCT)包埋，行坐骨神經橫切面冰凍切片，片厚14 μm。余下3只大鼠予腹腔麻醉后，快速取大小約為1 mm×1 mm×1 mm的術側坐骨神經組織，投入電鏡固定液中，于4 ℃固定2～4 h。

5.免疫熒光檢查

取冰凍切片進行免疫熒光檢測，一抗為兔抗大鼠LC3抗體(1∶200，CST公司)，于4 ℃過夜，加入熒光二抗dylight 488標記的山羊抗兔免疫球蛋白G(1∶800，Jackson Immuno Reseach公司)室溫孵育1 h，滴加含4，6-二脒基-2苯基吲哚(DAPI)抗熒光淬滅封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察并記錄LC3的表達。

6.蛋白免疫印跡

從超低溫冰箱取出坐骨神經樣本，提取蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度，根據所測蛋白濃度配制蛋白樣品，將蛋白樣品煮沸5 min。將30 μg蛋白上樣至12%濃度的變性聚丙稀酰胺凝膠，電泳后轉移至硝酸纖維膜，置5%脫脂奶粉(CST)室溫封閉1 h，分別加入兔抗大鼠LC3抗體(1∶1 000，CST公司)、P62抗體(1∶500，CST公司)，于4 ℃搖床過夜，加入HRP標記抗兔IgG二抗(1∶2 000，CST公司)，于搖床孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液(Millipore公司)曝光顯影。用ImageJ軟件分析各條帶的吸光度(A值)，計算目的蛋白與β-actin A值的比值即為相對表達水平。

7.電鏡檢查

從4 ℃冰箱取出固定的坐骨神經，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)充分漂洗，經1%鋨酸室溫下固定2 h，充分漂洗，置于乙醇中梯度脫水，于丙酮812包埋劑混合液(1∶1)中滲透過夜。包埋劑包埋樣本后，行超薄切片，經鈾鉛雙層染色，室溫風干。置于電鏡下尋找自噬體：定義為細胞中包裹著線粒體、內質網等細胞器或其他胞漿物質的雙層膜結構。

四、統(tǒng)計學處理

結 果

一、疼痛行為學測試結果

2組大鼠基線評分(足底基礎痛閾值)相等；Sham組術后第1、4、7日痛閾值均正常。經重復測量的方差分析結果顯示，時間與組別之間的交互效應具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，也即Sham組和CCI組大鼠術后痛閾值降低隨時間的變化趨勢不同。術后第1、4、7日2組痛閾值比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，見表1。

二、坐骨神經自噬的變化

1.免疫熒光結果

Sham組為均質綠染的LC3熒光信號，與Sham組比較，CCI組術后第4日及第7日出現(xiàn)較多綠色熒光斑點，見圖1。

表1 Sham組與CCI組各時間點MWT的變化 m/g

圖1 Sham組、CCI術后第4日、術后第7日大鼠坐骨神經LC3與DAPI雙標圖

2.蛋白免疫印跡檢測結果

Sham組坐骨神經LC3-Ⅱ蛋白表達水平低，P62蛋白表達明顯；與Sham組比較，CCI術后第4日，LC3-Ⅱ蛋白水平增高，P62蛋白表達減少(P均<0.01)，至CCI術后第7日，LC3-Ⅱ蛋白水平進一步上升(P<0.001)， P62蛋白表達水平亦較CCI術后第4日有所上升(P<0.05)，見表2及圖2。

表2 Sham組與CCI術后第4日、術后第7日大鼠坐骨神經LC3-Ⅱ及P62的相對蛋白灰度值

注：a與Sham組比較的P值；b與CCI 4 d比較的P值

圖2 蛋白免疫印跡檢測結果

3.電鏡觀察結果

CCI術后第4日，大鼠坐骨神經髓鞘腫脹，板層松散，髓鞘碎片形狀大小不一，施萬細胞呈幼稚化改變，核質比增大，胞質內可見膜結合碎片與溶酶體形成自噬溶酶體，也可見有雙層膜的自噬體，有髓纖維及部分無髓纖維內可見雙層膜的自噬體及自噬溶酶體，見圖3A～C。CCI術后第7日，大鼠坐骨神經髓鞘扭曲、溶解消失呈空泡狀，髓鞘碎片少，可見幼稚的施萬細胞及成髓鞘的施萬細胞，胞質內含有不同自噬階段的自噬體，僅少數(shù)有髓纖維出現(xiàn)微絲微管溶解，可見自噬溶酶體，見圖3D、E。

圖3 電鏡觀察CCI術后第4日、術后第7日大鼠坐骨神經超微結構(×20 000)

討 論

自噬是細胞內的一種“自食”現(xiàn)象，是指內質網來源的膜包繞胞質內蛋白與細胞器形成雙層膜結構的自噬體，之后與溶酶體結合形成自噬溶酶體，降解自噬體內容物，生成的產物供細胞循環(huán)再利用，這個過程也稱為自噬流[15]。在本研究中，筆者通過透射電鏡觀察CCI組大鼠的坐骨神經超微結構，在施萬細胞的胞質、有髓纖維及部分無髓纖維的神經元軸突內均可見雙層膜結構的自噬體及自噬溶酶體，提示CCI后損傷神經的施萬細胞及軸突神經元內發(fā)生了自噬。另有研究表明在大鼠Wallerian變性模型中，坐骨神經通過神經元軸突自噬及施萬細胞吞噬的方式清除變性軸突[16]。由此可知CCI后坐骨神經施萬細胞及軸突神經元通過自噬清除變性組織，從而創(chuàng)造影響NP的微環(huán)境。

自噬高度相關蛋白LC3在自噬體膜的延伸和成熟中發(fā)揮關鍵作用，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)被ATG4蛋白酶解掉一小段多肽，在ATG7、ATG3及ATG12形成復合物作用下，與磷脂酰乙醇胺共軛，形成膜結合型LC3(即LC3-Ⅱ)[17]。在2016年自噬研究指南中，以LC3-Ⅱ/actin作為自噬研究的關鍵指標。自噬是一個動態(tài)變化的過程，因此只檢測自噬體并不能準確評價自噬情況，還要檢測自噬的降解途徑是否順暢。P62是自噬溶酶體基本物質及泛素化結合蛋白，經自噬途徑降解，與自噬泡清除水平密切相關，常作為反映自噬流的一個指標[18]。曾有研究報道在C57b1/6實驗小鼠的CCI模型中發(fā)現(xiàn)周圍神經損傷1周內自噬被激活，但自噬過程未能正常完成[19]。筆者通過蛋白免疫印跡法檢測LC3-Ⅱ蛋白、P62蛋白的表達水平，結果同樣印證了CCI后自噬的激活，但是與之前研究不同的是，我們采用的是不同的動物品種及自噬檢測時間點，實驗結果顯示在CCI術后第4日，坐骨神經的自噬活性及自噬降解速度更強更快，至第7日，自噬體的下游降解能力減弱，提示大鼠坐骨神經損傷后局部自噬激活發(fā)生了動態(tài)的變化。

大鼠CCI模型是經典的誘導NP 的動物模型，通過輕度結扎坐骨神經，使有髓神經纖維選擇性地損傷，并保留多數(shù)傳遞痛感的C類纖維[13,20]。該模型能模擬神經受壓的臨床病例，影響神經血供和軸索運輸。在本研究中，筆者根據大鼠造模后的行為學改變進行測定，從而證明了CCI大鼠NP模型的成功建立。另外，還對大鼠CCI后坐骨神經局部自噬水平的表達及不同神經細胞的自噬形態(tài)進行了觀察。但是自噬在不同神經細胞內及細胞相互間是如何進行調控的，仍待進一步闡明。

綜上所述，大鼠坐骨神經損傷后局部自噬激活發(fā)生了動態(tài)的變化，不同的神經細胞之間(施萬細胞及軸突神經元)通過自噬清除變性組織，共同參與影響NP的微環(huán)境。在本研究中，筆者對NP中坐骨神經局部自噬的發(fā)生進行了初步探究，下一步將進行調控機制的相關研究，以期為今后的治療開拓新方向。