18F-DCFPyL的制備和初步臨床應(yīng)用

張曉軍，付華平，李云鋼，劉 健，何玉林，劉亞超，徐白萱，朱 虹，吳 江，崔孟超，張錦明

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100853；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；3.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210002；4.北京師范大學(xué) 放射性藥物重點(diǎn)實驗室，北京 100875)

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，近二十年我國男性前列腺癌發(fā)生率顯著上升，一方面由于生活方式的改變和環(huán)境因素的惡化導(dǎo)致癌癥發(fā)生率提高，另一方面，人們防癌意識的增強(qiáng)和健康檢查的普及使前列腺癌患者的檢出率增高，尤其是影像學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展使早期前列腺癌的檢出率極大提高[1]。前列腺特異性膜抗原(prostate-specifc membrane antigen, PSMA)又稱谷氨酸羧肽酶，在正常前列腺以及前列腺增生細(xì)胞表面有所表達(dá)，在絕大多數(shù)前列腺癌細(xì)胞中明顯上調(diào)，是前列腺癌特異性分子標(biāo)志。放射性核素標(biāo)記的PSMA小分子抑制劑在前列腺癌檢查和治療評價方面均展現(xiàn)出較大的臨床應(yīng)用價值[2]。基于藥效基團(tuán)谷氨酸-脲-賴氨酸(Glu-urea-Lys)，68Ga-PSMA-11是第一個谷氨酸尿素類小分子PET顯像劑，具有良好的生物學(xué)分布特征，常在臨床研究中作為對比探針，驗證其他PSMA類分子探針的有效性[3-6]。但螯合劑HBED-CC無法連接治療核素如177Lu或225Ac，且核素68Ga由發(fā)生器獲取，半衰期短，68Ga具有較高的正電子能量使PET圖像信噪比較低，其臨床應(yīng)用受到一定限制。18F是臨床應(yīng)用最廣泛的正電子核素，18F-DCFPyL(2-(3-{1-羧基-5-[(6-[18F]氟-吡啶-3-羰基)-胺基]-戊基}-脲基)-戊二酸)也是基于Glu-urea-Lys結(jié)構(gòu)開發(fā)的PSMA特異小分子顯像劑，具有親和力高，體內(nèi)藥代動力學(xué)良好的特征，臨床對比發(fā)現(xiàn)其各項性能優(yōu)于68Ga-PSMA-11[7-9]。本研究利用國產(chǎn)氟多功能模塊，對比不同的中間體水解方法，建立可靠、穩(wěn)定的18F-DCFPyL自動化合成方法，并進(jìn)行生物學(xué)分布和安全性評價，經(jīng)初步臨床應(yīng)用，獲得18F-DCFPyL人體分布特征。

1 材料與設(shè)備

1.1 實驗材料

1.2 實驗設(shè)備

Sumitomo HM-20S回旋加速器：日本住友公司；PET-MF-2V-IT-I型氟多功能合成模塊(配Alltech 626泵，Grace Alltima (10 mm×250 mm) C-18 柱)：派特(北京)科技有限公司；便攜式內(nèi)毒素快速檢測儀：美國Charles River公司；分析型HPLC檢測儀(配515泵，2487紫外檢測器，Phenomenex Gemini C-18分析柱(5 μ，100 ?，4.6 mm×150 mm)，BioScan流動放射性檢測器)：美國Waters公司；Hidex Automatic Gamma Counter：芬蘭Hidex公司；Biography truepoint 64 PET/CT掃描儀：德國西門子公司；GC 7890型氣相色譜儀和SS420X 工作站：上海天美公司；GHL-300型氫氣發(fā)生器：北京匯佳精儀公司。

1.3 實驗動物

正常雄性NIH小鼠20只，6～8周齡，(20±5) g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2015-0001。

1.4 患者

該研究已通過中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會審查。

一例入選者來自中國人民解放軍總醫(yī)院泌尿外科門診病人，69歲，前列腺癌切除術(shù)后5個月生化復(fù)發(fā)患者1例，血清總PSA(total prostate-specific antigen, tPSA)為1.86 ng/mL，游離PSA(free prostate-specific antigen, fPSA)為0.106 ng/mL。

2 實驗方法

2.1 18F-DCFPyL的制備條件

利用氟多功能模塊，18F-DCFPyL注射液的制備主要經(jīng)由以下步驟。合成路線示于圖2。

(1) 無水18F-的制備。加速器經(jīng)18O(p, n)18F反應(yīng)得到18F-，由N2氣體載帶至QMA柱(QMA柱預(yù)先以10 mL 0.075 mol/L TBAHC和10 mL純水活化)，0.9 mL淋洗液(0.3 mL 0.075 mol/L TBAHC和0.6 mL乙腈)將18F-淋洗至反應(yīng)管，通入N2并加熱至116 ℃將液體除干，2 mL無水乙腈分三次加入反應(yīng)管并分別蒸干，得到無水18F-。

(2) 親核反應(yīng)。冷卻反應(yīng)管至40 ℃，加入3號瓶中溶于0.5 mL無水乙腈的5 mg(6.25 μmol)前體，通入N2混勻后加熱至50 ℃，反應(yīng)5 min。

(3) 水解反應(yīng)。上述步驟相同，進(jìn)行三組實驗，分別使用三種酸水解中間體，分別是0.4 mL 85% H3PO4、1 mL 12 mol/L HCl和0.5 mL 57% HI，加入后均50 ℃加熱10 min。

(4) HPLC分離純化。水解后加入1 mL 2 mol/L NaOH中和，再加入2 mL流動相溶液稀釋，利用HPLC分離，流動相為10%乙腈水溶液，含0.1% 三氟乙酸，流速為4 mL/min，待產(chǎn)品放射性峰出現(xiàn)，收集產(chǎn)品至13號中轉(zhuǎn)瓶(預(yù)裝50 mL純水)。

(5) 固相萃取。將液體通過C18萃取小柱至廢液，再用20 mL注射用水清洗C18柱并吹干，最后以1.5 mL無水乙醇將18F-DCFPyL淋洗至無菌真空瓶，加入無菌注射用水稀釋至乙醇濃度低于10%，得到18F-DCFPyL注射液。

2.2 18F-DCFPyL的質(zhì)量控制

產(chǎn)品質(zhì)量控制主要包括性狀觀察、pH測量、核素鑒定、產(chǎn)品鑒定、放化純度測量、比活度測量、穩(wěn)定性測量、內(nèi)毒素含量檢測和有機(jī)溶劑殘留檢測。在鉛玻璃后觀察注射液性狀；以精密pH試紙測量；通過半衰期檢測法鑒定核素；以碘鉑酸試紙檢測法半定量K2.2.2含量；利用分析型HPLC，流動相為18% 乙醇水溶液，含0.2% H3PO4，流速為1 mL/min，紫外波長254 nm，將產(chǎn)品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品19F-DCFPyL共進(jìn)樣鑒定產(chǎn)品；放化純度、比活度和穩(wěn)定性均通過分析型HPLC測量計算得到；利用快速內(nèi)毒素檢測儀測量內(nèi)毒素含量；利用氣相色譜檢測有機(jī)溶劑殘留。

2.3 18F-DCFPyL的生物安全性評價

取NIH小鼠5只，每只小鼠尾靜脈注射0.2 mL的18F-DCFPyL(采用H3PO4水解方法制備，以下實驗均相同，比活度為89 GBq/μmol，濃度為555 MBq/mL，載體濃度為5 μg/mL，乙醇濃度為7.5%)，合計放射性為111 MBq/只，載體為50 μg/kg。觀察注射后小鼠的反應(yīng)，并稱重；另一組(5只)經(jīng)尾靜脈注射0.2 mL 7.5%乙醇溶液作為對照。飼養(yǎng)、觀察1周后稱重并處死，解剖，取主要器官做病理檢查。

圖1 18F-DCFPyL自動化合成模塊Fig.1 The module of auto-synthesis for 18F-DCFPyL

圖2 18F-DCFPyL的合成路線Fig.2 Radiosynthesis of 18F-DCFPyL

2.4 正常NIH小鼠體內(nèi)分布實驗

取正常NIH雄性小鼠15只，利用隨機(jī)數(shù)字表分為3組，每組5只，18F-DCFPyL產(chǎn)品經(jīng)注射用水稀釋后，經(jīng)尾靜脈每只注射1.85 MBq(0.2 mL，載體為0.083 μg)18F-DCFPyL，分別于注射后30、60、90 min脫頸處死，解剖并取血液、心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉和骨，稱重后置于Hidex Automatic Gamma Counter自動計數(shù)并衰減校正，計算不同時間點(diǎn)組織的放射性攝取值(%ID/g)。

2.5 臨床PET顯像

一例前列腺癌術(shù)后生化復(fù)發(fā)患者，為確定下一步治療方案，需確認(rèn)是否發(fā)生臨床復(fù)發(fā)，并判斷屬局部復(fù)發(fā)或區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，擬行18F-DCFPyL PET/CT檢查。患者經(jīng)常規(guī)臨床評估和實驗室檢驗，并簽署知情同意書后，由靜脈按3.70 MBq/kg(0.033 μg/kg)注射18F-DCFPyL，靜脈注射后60 min行全身PET/CT靜態(tài)顯像[8]。PET圖像采用三維采集模式進(jìn)行全身掃描，采集完成利用CT數(shù)據(jù)對PET圖像進(jìn)行衰減校正。PET圖像重建采用OSEM，CT重建采用標(biāo)準(zhǔn)重建法。以ROI技術(shù)勾畫感興趣區(qū)域并計算SUVmax。

3 結(jié)果與討論

3.1 18F-DCFPyL的制備

本研究利用PET-MF-2V-IT-I型氟多功能合成模塊進(jìn)行自動化合成，氟化反應(yīng)以四丁基銨碳酸氫酯為相轉(zhuǎn)移催化劑，可得到較高的親核效率，而以K2.2.2為相轉(zhuǎn)移催化劑，以K2CO3為堿時氟化效率降低[11]。盡管第一步氟化反應(yīng)效率較高，但中間體的三個保護(hù)基團(tuán)-叔丁基酯難以水解。本研究對比了三種強(qiáng)酸水解中間體，由于中間體含脲基和酰胺鍵，高溫強(qiáng)酸下易斷裂而發(fā)生副反應(yīng)，并且為了避免手性碳發(fā)生構(gòu)型翻轉(zhuǎn)，水解均在溫和條件下進(jìn)行。85% H3PO4、12 mol/L HCl和57% HI均能較好的水解中間體，最后得到的不校正放化產(chǎn)率分別為17.1%、16.9%和18.4%。而在實際應(yīng)用中，酸液從4號試劑瓶轉(zhuǎn)移至反應(yīng)管時，由于85% H3PO4粘度較大，較多H3PO4液體殘留在試劑瓶、管線和反應(yīng)管壁而無法進(jìn)入反應(yīng)管底參與水解反應(yīng)，使水解效率下降，若另引入微量(0.1 mL)乙腈清洗試劑瓶，可以較好的解決該問題；濃鹽酸粘度低，易于加入反應(yīng)管，也能較好的水解叔丁基酯，但濃鹽酸極易揮發(fā)，腐蝕性大，對合成設(shè)備的管線和電磁閥體可能造成損害；57% HI常用于制備11CH3I，其加入反應(yīng)管后，50 ℃加熱時可將管壁殘留的HI回流至管底，能穩(wěn)定的水解中間體，在18F-DCFPyL合成完畢，以大量的乙醇清洗反應(yīng)瓶、管線和反應(yīng)管，可有效保護(hù)設(shè)備，因此以HI為水解試劑具有較好的實際應(yīng)用價值。以10%乙腈水溶液(含0.1% TFA)為流動相，18F-保留時間為3 min，18F-DCFPyL的保留時間為10～12 min，相對應(yīng)可見紫外吸收峰(圖3)。由于未脫保護(hù)的中間體脂溶性大，該流動相無法洗脫中間體，若更換純乙腈可洗脫大量未水解中間體，約為50%～60%(未校正)，可見這三種酸均無法完全水解中間體，若更換強(qiáng)堿水解中間體，會導(dǎo)致副反應(yīng)的發(fā)生，因此，效率更高、副反應(yīng)少的水解方法仍待進(jìn)一步研究。

3.2 18F-DCFPyL的質(zhì)量控制

三種水解方法得到的18F-DCFPyL均進(jìn)行質(zhì)量控制。注射液呈無色澄清，pH為5～7，核素半衰期為(112±2) min，產(chǎn)品與標(biāo)準(zhǔn)品共進(jìn)分析型HPLC，二者相對保留時間一致(圖3)，放化純度大于98%，比活度為54～90 GBq/μmol，產(chǎn)品在4 h后放化純度仍大于95%，內(nèi)毒素含量低于5 Eu/mL，乙腈含量低于0.01%，K2.2.2含量低于50 μg/mL，注射液質(zhì)量符合臨床用藥標(biāo)準(zhǔn)(依據(jù)2015版《中國藥典》)。

3.3 18F-DCFPyL的生物安全性評價

注射18F-DCFPyL后NIH小鼠無任何異常表現(xiàn)，1周內(nèi)無死亡發(fā)生，小鼠注射藥物前體重為(20.5±2.4) g，一周后體重為(22.8±2.1) g，對照組注射前與注射后一周的體重分別為(20.9±1.7)g和(23.2±2.2)g，其體重變化程度與對照組無差別，主要器官病理切片檢查無異常。按千克體重計算，小鼠注射劑量為5.55 GBq/kg，載體劑量為50 μg/kg。正常人檢查劑量為370 MBq/65 kg/0.67 mL的18F-DCFPyL，比活度為5.55 MBq/kg，載體劑量為0.05 μg/kg(絕對量為3.25 μg)。此時，小鼠的放射性劑量約為人的注射劑量放射性1 000倍，化學(xué)載體近1 000倍，可見該藥物安全可靠。

3.4 正常NIH小鼠體內(nèi)分布實驗

18F-DCFPyL在正常NIH小鼠體內(nèi)分布示于圖4。18F-DCFPyL從血中清除很快，30 min攝取值為(1.18±0.12)%ID/g；主要經(jīng)泌尿系統(tǒng)排泄，腎臟攝取值高，且滯留時間長，直至90 min放射性攝取值仍為(175.52±11.28)%ID/g；藥物無法通過血腦屏障，腦內(nèi)攝取幾乎為本底；骨攝取值始終較低，可見18F-DCFPyL在體內(nèi)穩(wěn)定性較好，未發(fā)生脫氟；在肝、脾和肺組織均有一定的生理性攝取，尤其是脾臟，但均遠(yuǎn)低于腎的放射性攝取值?？梢娫撎结樑c68Ga-PSMA-11類似，主要經(jīng)腎臟代謝，導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)高攝取，而膀胱的高攝取將干擾前列腺組織微小病灶的探查。

a——18F-DCFPyL；b——19F-DCFPyL圖3 產(chǎn)品分析型HPLC圖譜a——18F-DCFPyL；b——19F-DCFPyLFig.3 Analytical HPLC profiles of 18F-DCFPyL and 19F-DCFPyL

圖4 18F-DCFPyL在正常NIH小鼠體內(nèi)分布Fig.4 Biodistribution of 18F-DCFPyL in normal NIH mice

3.5 臨床PET顯像

注射示蹤劑60 min后顯像，圖5a可見雙側(cè)腮腺及頜下腺對稱性生理性攝取，甲狀腺形態(tài)可見，頸部及鎖骨上區(qū)未見明顯異常淋巴結(jié)濃聚。肝臟放射性分布大致正常，胰腺形態(tài)放射性分布均勻，兩側(cè)腎臟顯影且密度均勻，腹部可見條

索狀腸影，膀胱放射性濃聚，盆腔內(nèi)多個淋巴結(jié)放射性攝取增高，最大者橫斷面約1.1 cm×0.8 cm，SUVmax為18.4，前列腺癌術(shù)后術(shù)區(qū)未見異常放射性攝取。圖5b1 CT可見盆腔內(nèi)(近右側(cè)附股溝區(qū))長徑約0.4 cm小淋巴結(jié)，伴放射性攝取值增高，SUVmax為3.6；圖5c2 PET圖像見骶骨局部放射性濃聚，SUVmax為5.2，但同機(jī)CT未見明顯骨質(zhì)密度改變。

前列腺根治性切除術(shù)是早期前列腺癌最常用治療方法，但患者復(fù)發(fā)比例較大，對于早期生化復(fù)發(fā)患者，當(dāng)PSA達(dá)到很高水平時，全身骨掃描、CT及MRI才可以發(fā)現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶，對PSA<10 μg/L生化復(fù)發(fā)患者的應(yīng)用價值有限。18F-DCFPyL是一個特異性PSMA顯像劑，有明確的代謝過程和排泄途徑，在其他正常組織中，18F-DCFPyL的分布很少，因此有很好的T/NT(腫瘤組織/非腫瘤組織放射性攝取)值。在PSA還處于較低水平時，18F-DCFPyL PET顯像能夠早期探測全身是否存在轉(zhuǎn)移灶。Rowe等[7-8]對比了18F-DCFPyL PET顯像與傳統(tǒng)檢查方式CT和99mTc-MDP骨掃描，8例轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者通過18F-DCFPyL顯像得到138處放射性攝取異常增高區(qū)域以及1處疑似增高區(qū)域，而CT與骨掃描僅得到30處確定病變區(qū)域以及15處疑似病變區(qū)域，該研究小組也證實18F-DCFPyL PET顯像能夠檢出Na18F和99mTc-MDP未檢出的前列腺癌骨轉(zhuǎn)移病灶。另一方面，在其他高表達(dá)PSMA的實體腫瘤中，小腸類癌、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌和高級別腦膠質(zhì)瘤的18F-DCFPyL PET檢查已見文獻(xiàn)報道，同樣表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[12-14]。

圖5 生化復(fù)發(fā)患者注射18F-DCFPyL 60 min后PET/CT檢查結(jié)果Fig.5 PET/CT imaging of patient with biochemical recurrence of prostate cancer at 60 minutes after 18F-DCFPyL injection

4 小結(jié)

利用國產(chǎn)氟多功能模塊，可以實現(xiàn)自動化合成18F-DCFPyL。H3PO4、HCl和HI三種酸的水解效率相近，但高效、穩(wěn)定的水解方法仍需進(jìn)一步研究。18F-DCFPyL注射液的質(zhì)量控制和小鼠安全性評價實驗證明該藥物安全可靠，符合臨床應(yīng)用要求。18F-DCFPyL在正常小鼠體內(nèi)經(jīng)泌尿系統(tǒng)排泄，其余臟器放射性攝取值低。前列腺癌術(shù)后生化復(fù)發(fā)的患者18F-DCFPyL PET顯像能夠探查同機(jī)CT無法檢出的微小轉(zhuǎn)移灶。18F-DCFPyL能夠更好的早期診斷前列腺癌及探測前列腺癌生化復(fù)發(fā)患者的病灶。