環(huán)狀RNA在孕婦18-三體綜合征的鑒定與分析

鄒耀霜 晏強 眭維國 歐明林 陳潔晶 湯冬娥 趙鑫 廖秋燕 戴勇*

(1.廣西師范大學生命科學學院，廣西 桂林541004；2. 解放軍第一八一醫(yī)院 腎臟科、全軍器官移植與透析治療中心、廣西代謝性疾病研究重點實驗室，廣西 桂林 541002；3. 暨南大學第二臨床醫(yī)學院深圳市人民醫(yī)院 臨床醫(yī)學研究中心，廣東 深圳 518020)

環(huán)狀RNA(circular RNAs, circRNAs)是一類通過反向剪接(backsplice)方式形成的非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)，大量存在于生物中[1，2]。1976年首次在類病毒中發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀RNA分子的形成[3]。20世紀90年代初期，發(fā)現(xiàn)circRNA是由許多基因的轉錄產(chǎn)生的，如腫瘤抑制基因DCC，原癌基因est-1和睪丸Sry[4,5]。然而，這些circRNA通常被認為是低豐度的，可能代表拼接錯誤。circRNA在不同物種中具有保守性，而且存在組織表達差異，可以作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)結合miRNA，阻斷miRNA對靶基因的抑制作用，具有開發(fā)疾病新型診斷與治療方法的巨大潛力[6，7]。最近，由于高通量RNA測序和新的計算方法的發(fā)展，已經(jīng)在各種細胞系和不同物種中成功鑒定了大量的circRNA。近來人們使用全基因組測序學方法來研究人類三體征(包括13-三體、18-三體和21-三體綜合征)，以鑒定這些特定非整倍性條件中的每一個的基因表達特征。染色體畸變與產(chǎn)前期和嬰兒早期的顯著發(fā)病率和死亡率有關[8]。18-三體綜合征又稱為愛德華綜合征(Edwards syndrome)，是常見的染色體三體征，是由于人類18號染色體增多1條造成的染色體畸變, 此類患兒臨床特征差異大，可從重度先天畸形到近似正常，嚴重的臨床特征為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受阻、臉部異常、生長較慢、骨骼反常、心臟和腎臟畸形等[9]。由于18-三體綜合征患兒在胎兒期即存在較高的自然流產(chǎn)率，故新生兒18-三體綜合征的患病率為1/8000～1/6000[10]，不能適應社會生活和缺乏正常勞動能力，對家庭及社會造成經(jīng)濟壓力。因此，探索新的無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查診斷指標和方法具有非常重要的臨床意義和商業(yè)價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年期間在181醫(yī)院和深圳市人民醫(yī)院產(chǎn)前篩查提示胎兒異常高風險，以及就診于優(yōu)生遺傳門診具有產(chǎn)前診斷指征為18-三體綜合征的2位孕婦的外周血以及臍帶血為實驗組，對照組為正常的相同孕周的孕婦外周血和臍帶血，年齡30～40歲，孕周28周和32周，混合血樣提取RNA進行全基因組測序。

1.2 實驗方法 孕婦了解穿刺存在的危險后并簽署知情同意書，在B超引導下行臍帶穿刺抽取胎兒臍血1～2ml，分析血紅蛋白成份鑒定為臍血后，按常規(guī)方法培養(yǎng)制片，加1ml血液接種于培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)72小時，加秋水仙素，滴低滲液破碎細胞，加固定液固定離心，去上清加1ml成懸浮液，滴片，顯微鏡下觀察進行核型分析。常規(guī)計數(shù)30個分裂相，手繪分析4個核型。如遇異常核型則分析計數(shù)50個核型以上。

1.3 測序方法 取診斷為懷有18-三體綜合征胎兒的母親的外周血用Trizol法提取RNA，每個樣品總量為5個樣品總量作為RNA樣品制備的材料，使用NanoDrop 2000c分光光度計(Nanodrop Technologies，Wilmington，DE)測定分離的RNA樣品的純度和產(chǎn)量。使用HiSeq PE Cluster Kit v4 cBot(Illumina)根據(jù)制造商的說明在cBot簇生成系統(tǒng)上進行索引編碼樣品的聚類。簇生成后，在Illumina Hiseq 2500平臺上對文庫制備物進行測序。

2 結果

通過對比圖1和圖2，發(fā)現(xiàn)圖1第18號多出1條染色體，經(jīng)染色體核型分析圖1診斷為18-三體綜合征，圖2核型分析母親的外周血核型圖。測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過刪除、過濾低質量數(shù)據(jù)之后，獲得了有效數(shù)據(jù)。對比圖3和圖4可以看出，兩組主要的基因類型主要分布在編碼蛋白質上，其他的無明顯變化。值得注意的是，lincRNA對比正常組有上升0.2%，在唐氏綜合征中鑒定出大量lncRNAs差異表達，與蛋白質編碼基因相比，lncRNA表達顯著增強(Kolmogorov-Smirnov檢驗，P<0.05)，表明lncRNAs在唐氏綜合征中發(fā)揮更重要的作用[11]。lincRNA的升高(如圖4)是否與18-三體綜合征的ceRNA的網(wǎng)絡調控有關系？值得進一步探索。反義RNA可通過與靶位序列互補而與之結合的RNA，或者直接阻止靶序列功能，或改變靶部位構象而影響其功能[12]。misc-RNA具有多種功能，包括一些類似酶的催化，參與RNA的形成過程，這些小RNA中的一些也可能作為開關，開啟和關閉基因，破壞mRNA來沉默基因[13]。

圖1 18-三體綜合征胎兒臍帶血染色體核型分析

圖2 18-三體綜合征孕婦外周血染色體核型分析

圖3 懷有18-三體綜合征的孕婦母血在已知基因類型的分布情況圖(位圖)

圖4 正常孕婦母血在已知基因類型的分布情況圖(位圖)

圖3、圖4結果文件說明，在已知基因類型的分布情況。采用HTSeq或Hisat2軟件對該物種樣品不同已知基因類型進行覆蓋度分析，使用的模型為維恩圖(union)。根據(jù)表達量統(tǒng)計樣品中各類型基因的的表達分布，得到reads在已知基因類型上的分布情況。

在circRNA的生物成因中，有幾種被提出的模型，包括剪接的依賴循環(huán)路徑(圖5)。18-三體樣本的環(huán)狀RNA的總數(shù)比正常對照組多，大概是1.3倍，由圖5可知，circRNA來源intergenic占63.20%，比正常人的38.80%多，正常人的circRNA來自外顯子占41.90%，而18-三體征樣本才占2.30%，這與環(huán)狀RNA絕大多數(shù)來源于外顯子，少部分由內(nèi)含子直接環(huán)化形成的特征有關。

圖5 樣本的circRNA的來源注： exon：環(huán)狀RNA位于已知基因的某一個外顯子內(nèi)，其序列由breakpoint之間的所有堿基構成；intergenic：環(huán)狀RNA位于已知基因的之間，其序列由breakpoint之間的所有堿基構成；intron：環(huán)狀RNA位于已知基因的某一個內(nèi)含子內(nèi)，其序列由breakpoint之間的所有堿基構成

圖5統(tǒng)計了樣本的circRNA的來源: circRNA可以來源于 exon 或 intron 的剪接。

所有circRNA的差異分析結果顯示(圖6)，樣本和對照組circRNA差異性表達共有13 278個，其中包括5007個上調，8271個下調。從中篩選出log2(Fold_change)差異系數(shù)大于或者等于5的共有7718個，差異系數(shù)最大(10.826)的為hg38_circ_0028679，以及hsa_circ_0005152、hg38_circ_0028661、 hsa_circ_0001649與hsa_circ_0003570等也有明顯的差異表達。

圖6 實驗組與對照組的差異表達的circRNA

3 討論

研究表明hsacirc 0001649在胃癌(GC)、肝癌(HCC)中顯著差異表達，并可能成為診斷GC的新的潛在生物標志物[14-16]。hsa_circ_0001649在18-三體綜合征與對照組中的顯著差異性表達上調具有非常重要的意義，極有可能為18-三體產(chǎn)前診斷的潛在生物標記物。此外，hsa_circ_0001649被認為可能具有包含miR-1283、miR-4310、miR-182-3p、miR-888-3p、miR-4502、miR-6811-5p、miR-6511b-5p和miR-1972的作用[17]。值得注意的是，18-三體細胞(包括干細胞和祖細胞)的增殖速率受損[18,19]，這可能部分與懷孕早期的流產(chǎn)有關，18-三體征胎兒的流產(chǎn)率高達72%[20,21]。大鼠差異表達基因的比較分析,基于通路的富集分析顯示，18-三體性顯示PI3K / AKT途徑失調，細胞周期G2/M DNA損傷檢查點調節(jié)以及細胞死亡和存活，如以及抑制上游調節(jié)劑TP53[22]。通過基因組富集分析和雙聚類，我們還發(fā)現(xiàn)大多數(shù)差異表達lncRNA與線粒體功能密切相關。目前對環(huán)狀RNA功能的研究主要集中在競爭性內(nèi)源性RNA (ceRNA)上。circRNA影響轉錄后調控的功能主要通過被當做海綿吸附miRNA來實現(xiàn)的[23]。

我們使用了全基因組測序的方法選擇性分析了懷有18-三體綜合征的孕婦的外周血中circRNA的差異性表達，對18-三體綜合征和正常細胞增殖控制中的作用，涉及增殖控制和細胞凋亡的過程對三體征息息相關。值得注意的是，hsa_circ_0001649的表達在18-三體與對照組的比對顯著上升，極有可能是18-三體綜合征的產(chǎn)前診斷標記物，可能與18-三體綜合征的激活體系相關，為無創(chuàng)性的18-三體產(chǎn)前診斷提供一定的依據(jù)。Koide K等[24]比較了孕18-三體母細胞和整倍體胎兒的羊水中的無細胞胎兒RNA的全球GE(基因表達)，并發(fā)現(xiàn)在18-三體樣品中與細胞死亡網(wǎng)絡相關的基因被下調。越來越多的證據(jù)表明組蛋白乙酰化參與染色質重塑，進而影響生物學過程，包括細胞凋亡[25]。

18-三體綜合征的檢測仍然是產(chǎn)前篩查的主要目的，circRNA是一個長期被忽略的RNA種類，最近在新興的非編碼RNA家族中得到了關注。新一代測序和生物信息學技術的進步已經(jīng)揭示了人類細胞中的一萬多個circRNAs。雖然大多數(shù)這些circRNA的調節(jié)和功能仍然難以捉摸，但是研究開始探索它們的作用以及某些circRNA的臨床意義。此外，許多circRNA在癌癥和正常組織之間差異表達，表明這些circRNA可能在癌癥中具有潛在功能和臨床相關性。然而，circRNA在產(chǎn)前診斷中的研究尚處于起步階段，關于它們的生物發(fā)生，調節(jié)和功能還有許多尚未解答的問題。而circRNA的作用機制還遠未完全了解。circRNA可能在多個水平上調節(jié)基因表達。由于大部分的circRNA是由前體mRNAs產(chǎn)生的，主要被加工成成熟的mRNA，因此circRNAs與其宿主基因之間是否存在不同的調控和功能是一個值得探討的課題。此外，這一領域為產(chǎn)前診斷和環(huán)狀RNA治療開辟了新的可能性。

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