胎盤來源干細(xì)胞研究進(jìn)展

劉太行 王應(yīng)雄 丁裕斌

(重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院 生殖生物學(xué)實驗室，重慶 400016)

人類胎盤(placenta)由胎兒的叢密絨毛膜與母體的基蛻膜共同組成的圓盤形結(jié)構(gòu)，是母體與胎兒間物質(zhì)交換的器官。每個人出生之前都依賴胎盤生存，胎盤不僅擔(dān)負(fù)著胎兒的肺和腎的功能，還負(fù)責(zé)產(chǎn)生重要的激素，維持正常妊娠。雖然，“胎盤是人們了解得最少的一種人類器官，在科學(xué)界人們大多忽視了胎盤的存在”[1]；但是，作為人體的“免疫特區(qū)”，胎盤組織中進(jìn)行的干細(xì)胞分離和功能研究已經(jīng)進(jìn)入了一個新的時代[2]。多能性胎盤干細(xì)胞用來移植修復(fù)受損或病變器官不僅免疫原性弱，同時對機體免疫還有一個負(fù)調(diào)控作用，這就給胎盤干細(xì)胞的應(yīng)用提供了一個非常大的發(fā)展空間，也被大家寄予了無限厚望。目前科學(xué)發(fā)現(xiàn)的四類主要胎盤干細(xì)胞中，得到廣泛研究和臨床實驗的主要是胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞和胎盤造血干細(xì)胞。本文將就這兩種胎盤來源的干細(xì)胞特征及未來在臨床上的應(yīng)用潛力進(jìn)行介紹并分析其生物學(xué)特性。

1 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(PMSCs)

胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(placenta-derived mesenchymal stem cells, PMSCs)是一種多能干細(xì)胞，來源于胚胎發(fā)育早期的中胚層。Jaroscak等[3]首先報道了關(guān)于胎盤來源的干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)胎盤貼壁細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)表達(dá)基本相似的細(xì)胞表面標(biāo)志，都具有多向分化潛能，但胎盤貼壁細(xì)胞的同質(zhì)性不如BMSC。隨后，大量的研究發(fā)現(xiàn)胎盤的各個部位，如臍帶、羊膜、絨毛膜、以及底蛻膜均含有間充質(zhì)干細(xì)胞。不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞有共同的特征，但也存在一些不同之處。目前PMSCs因具有顯著的增殖和多向分化潛能以及獨特的免疫學(xué)特點，得到廣泛而深入的研究。

1.1 PMSCs的擴增與分化 特征PMSCs在形態(tài)上與BMSCs類似，為典型的成纖維細(xì)胞樣，并呈漩渦狀生長。PMSCs易于分離擴增，體外倍增能力旺盛，體外擴增至20代，細(xì)胞形態(tài)不發(fā)生明顯改變，在指數(shù)生長期的倍增時間約為21～25小時[4]。PMSCs的擴增能力明顯強于成年(平均年齡30歲)健康女性志愿者的BMSCs。PMSCs表達(dá)典型的間充質(zhì)抗原，如CD90、CD73、CD105、CD13、CD44、CD29、CD166、CD117、HLA-A，-B，-C、CD49e、CD29等；缺乏造血細(xì)胞表面標(biāo)志 CD34、CD45、CD14、HLA2DR和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志vWF、Flk21、CD31、KDR以及共刺激因子CD80、CD86、CD40L和HLA-DR等。PMSCs[5]還可表達(dá)某些胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)記SSEA24、TRA21261、TRA21280，提示 PMSCs可能是非常原始的細(xì)胞群，比成體干細(xì)胞(adult stem cells, ASC)具有更廣泛的自我更新和多系分化能力。PMSCs中存在多潛能標(biāo)志物Sox-2、OCT-4、Nanog和SSEA-4[6]，還表達(dá)器官特異性基因 renin、nestin、GFAP、 amylase等基因，但Rex21的表達(dá)隨細(xì)胞代數(shù)增加而消失。體外培養(yǎng)的實驗研究發(fā)現(xiàn)，在不同的誘導(dǎo)條件下，PMSCs可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和神經(jīng)元，表明PMSCs具有廣泛的分化潛能[7]。PMSCs即使擴增1億倍仍能保持其多向分化能力。由于PMSCs具有強大的增殖能力和在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下分化為多種細(xì)胞的能力，因而胎盤可作為一種重要的參與組織再生的細(xì)胞庫，即在組織損傷引起的特殊信號作用下，PMSCs遷移到受損部位，在局部聚集增殖，依據(jù)不同的損傷信號沿著不同途徑分化。

1.2 PMSCs的免疫學(xué)特性 PMSCs在免疫學(xué)上有其突出的特點：①免疫抑制作用：PMSCs可抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的部分免疫功能。其作用機制包括抑制免疫細(xì)胞的增殖、抑制可溶性細(xì)胞因子、抑制細(xì)胞毒性物質(zhì)的分泌。這就使得治療用的PMSCs不僅可以用于自體，也可以用于異體。②“免疫赦免”作用：PMSCs具有抑制同種異體免疫反應(yīng)、降低移植物抗宿主反應(yīng)的作用，在某種程度上，自身能躲過免疫防御機制的作用，即“免疫赦免”[8]。③強大的免疫調(diào)節(jié)作用：PMSCs具有較低免疫原性的特點，不表達(dá)CD80、CD86和CD40等T淋巴細(xì)胞活化所需的共刺激分子，僅表達(dá)MHC-I。雖然MHC-I可以激活異物反應(yīng)T細(xì)胞，但是由于缺乏協(xié)同刺激因子，導(dǎo)致信號傳導(dǎo)受限，因此，最終免疫細(xì)胞對PMSCs無細(xì)胞免疫反應(yīng)[9]。 此外，PMSCs可以與多種免疫細(xì)胞相互作用，抑制有絲分裂原或同種異體抗原誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖的能力，阻斷單核細(xì)胞成熟為樹突狀細(xì)胞的能力，是其免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的另一個實例[6]。強大的免疫調(diào)節(jié)作用使得移植的PMSCs在修復(fù)受損組織的同時，還可以調(diào)節(jié)患者的免疫狀態(tài)。④低免疫原性：PMSCs具有低免疫原性，與同種異體人外周血單核細(xì)胞(PBMC)及異基因動物豬的 PBMC共培養(yǎng)，無刺激細(xì)胞增殖的現(xiàn)象，并通過非直接接觸的作用方式抑制人同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)，這避免了胚胎干細(xì)胞等全能干細(xì)胞致瘤性風(fēng)險。

1.3 PMSCs在相關(guān)疾病治療中的實驗與臨床研究 PMSCs由于其獨特的干性及免疫調(diào)節(jié)特性，被廣泛應(yīng)用于免疫介導(dǎo)性炎癥的治療及移植修復(fù)受損或病變器官。Chen等[10]發(fā)現(xiàn)在促進(jìn)分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的條件下培養(yǎng)。使用包含堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，全反式維A酸(RA)，抗壞血酸(AA)和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)的混合物，在體外誘導(dǎo)PMSCs成為多巴胺神經(jīng)元。而且，它們可以誘導(dǎo)成為脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞。當(dāng)用bFGF、RA、AA和IBMX誘導(dǎo)PMSCs時，它們的形態(tài)變化與神經(jīng)元樣細(xì)胞相似。Park等[11]將分離的PMSCs注入帕金森大鼠模型的紋狀體內(nèi)，在24周的觀察周期內(nèi)可見小鼠的運動功能幾乎恢復(fù)正常。免疫組化及PET掃描可見分泌多巴胺的細(xì)胞生成，證實了注入的細(xì)胞在體內(nèi)能向神經(jīng)細(xì)胞分化。體外實驗結(jié)果顯示了PMSCs的分化潛能和有效的旁分泌效應(yīng)。PMSCs在體內(nèi)存活至少3周，并能促進(jìn)新毛細(xì)血管的形成，小動脈的增加及各種促血管生成因子的分泌，從而加速缺血恢復(fù)。PMSCs直接通過分化為特定細(xì)胞和分泌相關(guān)細(xì)胞因子參與血管生成[12]。Reddy等[13]發(fā)現(xiàn)與臍帶來源的干細(xì)胞、胎兒骨髓來源的干細(xì)胞以及脂肪組織來源的干細(xì)胞比較，PMSCs顯示了最強的成骨能力。PMSCs是人體微環(huán)境的重要組成部分，移植PMSCs可以改變造血微環(huán)境，重建免疫系統(tǒng)，促進(jìn)造血功能恢復(fù)，與造血干細(xì)胞共移植能可能顯著提高白血病和難治性貧血等的治療效果。

目前國際上已經(jīng)有很多胎盤來源干細(xì)胞的臨床研究，在美國國立衛(wèi)生研究院的最大臨床試驗注冊庫ClinicalTrials.gov網(wǎng)站上，至2016年，胎盤干細(xì)胞的臨床實驗已有22項，主要集中在北美，其中中國境內(nèi)有4項。治療相關(guān)的疾病包括：多發(fā)性硬化、重型再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征、白血病等惡性或非惡性血液疾病，還有2型糖尿病、特發(fā)性肺纖維化、強直性脊柱炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等非血液系統(tǒng)疾病[14]。

2 胎盤造血干細(xì)胞(placenta-derived hematopoietic stem cell, PHSCs)

胎盤具有造血功能的觀點早已有之(圖1)，Till和McCulloch[15]首次提出了胎盤含有大量具有高度增殖潛力的無性系造血細(xì)胞。Dancis等[16]第一次證明了小鼠胎盤中含有造血前體細(xì)胞。此后，King等[17]發(fā)現(xiàn)胎盤絨毛膜存在基質(zhì)和血管前體細(xì)胞，其后Demir等[18]從胎盤絨毛膜鑒別出分化成血液細(xì)胞和血管細(xì)胞的血液血管干細(xì)胞。另外，相對于骨髓來說，胎盤具有更適合造血干細(xì)胞增殖的內(nèi)環(huán)境——包括造血因子的表達(dá)、血管內(nèi)皮的類型、血流切力影響、表面分子的改變、血氧濃度等[19]，都進(jìn)一步說明胎盤中可能存在PHSCs。

圖1 人類胎兒及胎盤的造血功能

以人類妊娠起始、妊娠中期到足月期的孕周數(shù)為時間軸，卵黃囊、AGM(人主動脈-性腺-中腎)造血集群、肝臟及胎盤中造血干細(xì)胞出現(xiàn)的時空順序。紅細(xì)胞系爆裂樣生成單位(BFU-E)代表最早的紅細(xì)胞祖細(xì)胞，多能性祖細(xì)胞能產(chǎn)生紅細(xì)胞及髓樣譜系細(xì)胞[19]。

研究還發(fā)現(xiàn)SALL4和BMI-1等造血相關(guān)基因在胎盤中高表達(dá)[20]。轉(zhuǎn)錄因子Evi1作為造血干細(xì)胞自我更新及多向再植入能力的標(biāo)志因子之一，也在胎盤中顯著表達(dá)[21]。小鼠的胎盤從E9開始成為造血祖細(xì)胞來源，造血干細(xì)胞數(shù)量在E12.5時期明顯上升，而在E15.5之后的胎盤中很少有造血干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，此時干細(xì)胞開始遷移至胎肝。與鼠不同的是，人類從懷孕第6周開始有造血干/祖細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，在終末期胎盤仍可以發(fā)現(xiàn)，提示人類胎盤是造血干細(xì)胞的重要來源之一。此后，一系列經(jīng)典實驗證明了胎盤是一個自主的造血干細(xì)胞的起源，而非由其他造血位點產(chǎn)生然后定植于胎盤。Zeigler等[22]及Corbel等[23]進(jìn)行的兩項單獨的研究顯示，在建立循環(huán)之前分離的尿囊和絨毛膜具有在外植體培養(yǎng)之后產(chǎn)生髓細(xì)胞和明確的紅細(xì)胞的潛力，提示尿囊和絨毛膜具有獨立的造血潛能。這些結(jié)果均表明胎盤不僅是造血干細(xì)胞龕，而且也是造血細(xì)胞的源泉。

2.1 PHSCs的生物學(xué)特性 PHSCs表達(dá)許多與胎肝和骨髓來源造血干細(xì)胞相同的標(biāo)記因子，包括CD34和c-kit。而且，鼠胎盤造血干細(xì)胞表達(dá)的Sca-1也在成體骨髓造血干細(xì)胞中表達(dá)。人類的造血干細(xì)胞真正的表面標(biāo)記至今仍沒有完全確定，但在試驗及臨床應(yīng)用中，人們常常把 CD34抗原作為重要標(biāo)志來鑒定和分離人造血干/祖細(xì)胞。Serikov等[24]第一次證明人類胎盤可以提供大量的PHSCs，這些細(xì)胞表達(dá)其他造血前體標(biāo)志物如CD90、CD38和CD133，但不表達(dá)CD31或KDR。

胎盤獲得的CD34+細(xì)胞百分率是臍帶血的8.8倍，CD34+/CD38-細(xì)胞和CD34+/CD38+細(xì)胞百分率分別是臍帶血的4.6倍和11.9倍，說明胎盤組織中含有比臍帶血更豐富的PHSCs。另外，胎盤中的淋巴細(xì)胞總數(shù)、T細(xì)胞(CD3+/CD2+)、B細(xì)胞(CD19-)、Th細(xì)胞(CD3+/CD4+)及Th/Ts比值均明顯低于臍帶血，而CD8+/CD28-抑制性T細(xì)胞則明顯高于臍帶血，說明PHSCs的免疫原性要低于臍血和外周血造血干細(xì)胞。

目前，人類足月的胎盤是一個有活性且具有功能的造血干細(xì)胞很好的來源，利用胎盤循環(huán)及干細(xì)胞受體阻斷的方法，可以在無菌狀態(tài)下以非破壞性的方法輕易地取得大量的造血干細(xì)胞。動物實驗也更進(jìn)一步證明PHSCs可以在免疫缺乏的小鼠重建它的造血系統(tǒng)。利用Serikov等[24]發(fā)展出來的方法取得PHSCs可以增強臍帶血為主的治療或取代骨髓的移植，都將極大地改變整個移植領(lǐng)域。

2.2 PHSCs的臨床應(yīng)用潛力 PHSCs是存在于胎盤組織中的一群原始造血細(xì)胞，可以分化形成各種血細(xì)胞(紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等)，是高度未分化的細(xì)胞，也是所有造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞的祖細(xì)胞，可潛在用于可治療血液疾病，如急慢性白血病、再生障礙性貧血、地中海貧血和淋巴瘤，部分惡性腫瘤，部分遺傳性疾病等。PHSCs也被用于其他疾病的治療試驗，例如，PHSCs中的CD34+細(xì)胞能夠遷移到脊髓受損部位，并向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化，從而修復(fù)脊髓損傷。此外，PHSCs移植在治療慢性進(jìn)行性舞蹈病、腦梗死、阿爾茨海默病、肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化、大腦損傷和脊位損傷也在部分實驗中取得療效。PHSCs中還存在著大量的較幼稚干細(xì)胞，向血液系統(tǒng)之外的其他系統(tǒng)分化，如在肝細(xì)胞、心肌、皮膚、軟骨和骨骼肌等。除以上疾病外，還被用于1型糖尿病、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷等代謝障礙和免疫缺陷性疾病的治療[25]。PHSCs以其采集方便、實物儲存、配型幾率高以及排異反應(yīng)小等優(yōu)勢被視為骨髓的替代。

2.2.1 取材來源容易 過去胎盤常作為廢物被丟棄，故PHSCs的提取對產(chǎn)婦及新生兒沒有任何影響。活的PHSCs也同樣可以由整個冷凍的胎盤得到，由胎盤組織分離的細(xì)胞在試管內(nèi)可以分化成所有血液的細(xì)胞。分離的PHSCs保存在專業(yè)的低溫冷凍液氮罐中，可以保證其安全和可用性。

2.2.2 配型幾率高 異體造血干細(xì)胞移植需要組織配型相合，無關(guān)供體間配型相合的幾率僅為15～20萬分之一。即便主要組織相容性抗原相合，在很多亞位點也有所不同，也會出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，影響移植效果，移植成功率低。而自體應(yīng)用具有完美的組織配型，不會出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，移植的成功率高，對于同家族親屬來講，也有1/2～1/4配型相合的幾率，配型率高。

2.2.3 數(shù)量豐富 臍帶血來源造血干細(xì)胞存在30kg重使用的瓶頸；骨髓、動員后外周血提取的造血干細(xì)胞數(shù)量可供1個成人使用；胎盤造血干細(xì)胞數(shù)量豐富，從胎盤組織中直接提取的造血干細(xì)胞是臍帶血的8～10倍，可能供小孩自用幾次或1～2個成人患者進(jìn)行治療。PHSCs有效地解決了移植時骨髓或者動員后外周血來源不足、臍帶血數(shù)量不夠等技術(shù)難題，是替代骨髓的珍貴生物資源。

2.2.4 PHSCs更為早期，增殖能力強，排斥反應(yīng)低、無倫理障礙等優(yōu)點。

3 結(jié)語

綜上所述，胎盤是包括造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞在內(nèi)多種干細(xì)胞的存儲器官，這些干細(xì)胞具有較強的自我更新及多向分化潛能，免疫原性缺乏或較低，且具有免疫調(diào)節(jié)的特性；更重要的是，這些干細(xì)胞相對來說更容易獲取和分離，無倫理方面擔(dān)憂。因此，對于一系列以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療方法來說，胎盤來源干細(xì)胞在同種同體及同種異體移植治療中具有更廣闊的應(yīng)用前景。但是，目前還需要進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞采集的技術(shù)，提高分離效率和純度，更深入的實驗研究胎盤來源干細(xì)胞在體內(nèi)、外發(fā)揮效應(yīng)的分子與細(xì)胞機制，挖掘它們的治療潛力，以便為今后臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] Guttmacher AE, Maddox YT, Spong CY.The Human Placenta Project: placental structure, development, and function in real time[J]. Placenta,2014,35(5):303-304.

[2] Chien CC, Yen BL, Lee FK, et al. In vitro differentiation of human placenta-derived multipotent cells into hepatocyte-like cells[J]. Stem Cells,2006，24(7):1759-1768.

[3] Jaroscak J, SmithT, HaynesworthS.et al. Preliminary characterization of the surface staining of placental derived adherent cells: a potential new source of stroma for umbilical cord blood (ucb) expansion[J]. Blood,2000, 96(11):150b.

[4] Fukuchi Y, Nakajima H, Sugiyama D, et al.Human placenta-derived cells have mesenchymal stem/progenitor cell potential[J]. Stem Cells,2004,22(5):649-658.

[5] 吳潔瑩,張毅.胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞研究進(jìn)展[J].中國實驗血液學(xué)雜志,2004,13(3):514-517.

[6] Kmiecik G, Spoldi V, Silini A,et al. Current view on osteogenic differentiation potential of mesenchymal stromal cells derived from placental tissues[J]. Stem Cell Rev,2015,11(4):570-585.

[7] Yen BL, Huang HI, Chien CC, et al. Isolation of multipotent cells from human term placenta[J].Stem Cells,2005,23(1):3-9.

[8] Karlsson H, Erkers T, Nava S, et al. Stromal cells from term fetal membrane are highly suppressive in allogeneic settings in vitro[J]. Clin Exp Immunol,2012,167(3):543-555.

[9] Lee JM, Jung J, Lee HJ, et al.Comparison of immunomodulatory effects of placenta mesenchymal stem cells with bone marrow and adipose mesenchymal stem cells[J]. Int Immunopharmacol,2012,13(2):219-224.

[10] Chen L, He DM, Zhang Y. The differentiation of human placenta-derived mesenchymal stem cells into dopaminergic cells in vitro[J]. Cell Mol Biol Lett,2009, 14(3):528-536.

[11] Park S, Kim E, Koh SE, et al. Dopaminergic differentiation of neural progenitors derived from placental mesenchymal stem cells in the brains of Parkinson's disease model rats and alleviation of asymmetric rotational behavior[J]. Brain research,2012,1466:158-166.

[12] Liang L, Li Z, Ma T, et al. Transplantation of human placenta-derived mesenchymal stem cells alleviates critical limb ischemia in diabetic nude rats[J]. Cell Transplant, 2017, 26(1):45-61.

[13] Reddy S,Wasnik S, Guha A, et al.Evaluation of nano-biphasic calcium phosphate ceramics for bone tissue engineering applications: in vitro and preliminary in vivo studies[J]. J Biomater Appl,2013,27(5):565-575.

[14] Trounson A, McDonald C. Stem cell therapies in clinical trials: progress and challenges[J]. Cell Stem Cell,2015,17(1):11-22.

[15] Till JE, Mc CE. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells[J]. Radiat Res,1961,14:213-222.

[16] Dancis J, Jansen V, Gorstein F, et al. Hematopoietic cells in mouse placenta[J]. Am J Obstet Gynecol,1968,100(8):1110-1121.

[17] King BF. Ultrastructural differentiation of stromal and vascular components in early macaque placental villi[J]. Am J Anat,1987,178(1):30-44.

[18] Demir R, Kaufmann P, Castellucci M, et al.Fetal vasculogenesis and angiogenesis in human placental villi[J]. Acta Anat (Basel),1989,136(3):190-203.

[19] Dzierzak E, Robin C. Placenta as a source of hematopoietic stem cells[J]. Trends Mol Med,2010,16(8):361-367.

[20] Chen S, Liu S, Xu L, et al.The characteristic expression pattern of BMI-1 and SALL4 genes in placenta tissue and cord blood[J]. Stem Cell Res Ther,2013, 4(2):49.

[21] Kataoka K,Sato T, Yoshimi A, et al.Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity[J]. J Exp Med，2011,208(12):2403-2416.

[22] Zeigler BM,Sugiyama D, Chen M, et al. The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential[J]. Development, 2006, 133(21):4183-4192.

[23] Corbel C, Salaun J, Belo-Diabangouaya P, et al. Hematopoietic potential of the pre-fusion allantois[J]. Dev Biol,2007, 301(2):478-488.

[24] Serikov V, Hounshell C, Larkin S, et al.Human term placenta as a source of hematopoietic cells[J]. Exp Biol Med (Maywood),2009, 234(7):813-823.

[25] 徐志國,超劉,閆銘杰. 人胎盤來源干/祖細(xì)胞生物學(xué)特性研究進(jìn)展[J]. 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志,2013,2(6):336-340.