狗脊多糖對硝普鈉誘導退變大鼠軟骨細胞氧自由基影響的研究

付長龍 梅陽陽 李民 黃志強 黃艷峰 林晴 鄭春松 葉錦霞

【摘 要】目的：觀察狗脊多糖對硝普鈉（SNP）誘導退變大鼠軟骨細胞氧自由基的影響，為其在骨關(guān)節(jié)炎的臨床應用提供理論依據(jù)。方法：采用水提醇沉法、Sevag法除蛋白提取純化獲得狗脊多糖，苯酚-硫酸比色法測定其多糖含量；酶聯(lián)免疫吸附測定法分別檢測體外培養(yǎng)大鼠軟骨細胞空白對照組、模型對照組、各劑量狗脊多糖組（100，200，400，800 μg·mL-1）的超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）的含量。結(jié)果：狗脊多糖含量為76.91%，精密度試驗RSD = 1.86%，表明儀器精密度良好，且穩(wěn)定性試驗RSD = 1.98%，平均回收率試驗為95.4%，RSD = 1.83%；酶聯(lián)免疫吸附法檢測經(jīng)SNP造模后軟骨細胞氧自由基表達結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型對照組SOD、NO、MDA含量表達差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.01），提示軟骨細胞退變模型建立；與模型對照組比較，各劑量狗脊多糖組（100，200，400，800 μg·mL-1）干預48 h后，可上調(diào)SOD含量，下調(diào)NO、MDA含量，其中以200 μg·mL-1組表達最顯著（P < 0.01）。結(jié)論：苯酚-硫酸比色法可作為狗脊多糖的含量測定方法；狗脊多糖可降低經(jīng)SNP造模后軟骨細胞中異常氧自由基含量表達，上調(diào)抗氧化因子水平，發(fā)揮抗氧化作用。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎，膝；狗脊多糖；軟骨細胞；氧自由基；大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the effects of Rhizoma Cibotii polysaccharides on oxygen free radicals in rats' degenerative chondrocytes induced by sodium nitroprusside（SNP）and provide a theoretical basis for its clinical application in osteoarthritis.Methods：Polysaccharide was extracted and purified with water extraction and Sevag methods，and the polysaccharide content was determined by the phenol sulfuric acid colorimetry.The enzyme linked immunosorbent assay was used to detect the contents of superoxide dismutase（SOD），nitric oxide（NO）and malondialdehyde（MDA）respectively in the blank group，the model group and the Rhizoma Cibotii polysaccharides group（100，200，400，800 μg·mL-1）.Results：The Rhizoma Cibotii polysaccharide content was 76.91% and the precision experiment showed RSD = 1.86%，which showed that the precision of the instrument was good.The stability test showed RSD = 1.98%，the average recovery test was 95.4%，and RSD was 1.83%.The enzyme linked immunosorbent assay showed that the differences between the contents of SOD，NO and MDA in the model group and thosein the blank group were statistically significant（P < 0.01），suggesting that the chond-rocyte degeneration model was established.Compared with the model group，after the intervention to the experimental group（100，200，400，800 μg·mL-1）for 48 h，the contents of SOD could be up regulated and the content of NO and MDA could be down regulated，with the group of 200 ?g·mL-1 the most significant（P < 0.01）.Conclusion：The phenol sulfuric acid colorimetry can be used to determine the content of the Rhizoma Cibotii polysaccharide.Rhizoma Cibotii polysaccharide can reduce the expression of the abnormal oxygen free radical content in the chondrocytes after the SNP model，up-regulating the level of antioxidant factors and playing an antioxidant role.

【Keywords】 osteoarthritis，knee；Rhizoma Cibotii polysaccharide；chondrocytes；oxygen free radicals；rats

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種主要由生物學因素及力學異常影響下導致關(guān)節(jié)軟骨漸進退變的慢性關(guān)節(jié)疾病。目前，在全球范圍內(nèi)KOA發(fā)病形勢嚴峻，患病人口眾多，其臨床常以關(guān)節(jié)部位的疼痛、關(guān)節(jié)僵硬等癥狀伴隨始終，具有很高的致殘率[1-3]。鑒于當前缺乏從根本上治療和延緩病程的有效手段，因此，尋找一種安全、適用、便捷的治療方法是今后治療追求的目標。中醫(yī)學對KOA的治療認識古已有之，治療方法豐富多樣，具有較高安全性、方便經(jīng)濟特點，且臨床具有良效[4]。鑒于KOA的根本病機是本虛標實，因此，施以補腎柔肝，兼以祛風、除濕作用的中藥，方切合其治則[5]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)中藥多糖可有效抑制KOA的發(fā)生和發(fā)展，中藥多糖能夠改善局部微循環(huán)，降低骨內(nèi)壓、改善滑膜炎癥、調(diào)節(jié)異常細胞因子含量表達及發(fā)揮對軟骨細胞凋亡的抑制作用，從而可在一定程度上有效抑制KOA的發(fā)生和發(fā)展[6]。而狗脊多糖是從中藥狗脊中提取的活性物質(zhì)，前期研究發(fā)現(xiàn)，其對軟骨細胞活性具有正向調(diào)控作用[7]。因此，本研究進一步研究其對SNP誘導大鼠軟骨細胞退變模型氧自由基的影響，為探討其作用機制提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物和藥物 健康SD雄性大鼠16只（清潔級），體質(zhì)量約為90 g，飼養(yǎng)環(huán)境終年維持溫度23～25 ℃，濕度55%～60%，每小時換風16次，12 h光照/12 h黑暗自動控制循環(huán)光照條件。上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2007-0005。制狗脊由福建省尤溪仙錦藥業(yè)有限公司提供。

1.2 主要試劑 D-無水葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201104）；磷酸鹽緩沖液（美國HyClone公司，批號NZM1284）；DMEM/LOW GLUCOSE（美國HyClone公司，批號NZK1239）；SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20140606）；NO試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20140528）；MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20140527）等。

1.3 主要儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；紫外分光光度計（島津公司）；Bio-tek酶標儀（美國Bio-Tek公司）；低溫高速離心機（美國BECKMAN，64R型）；無菌操作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，AIRTECH型）。

2 方 法

2.1 狗脊多糖的提取 稱取狗脊藥材50 g，依次經(jīng)粉碎、篩檢、脫脂（石油醚），提取1次，提取2次（均為10倍體積蒸餾水/次/2 h），收集提取液2次，抽濾減壓，濃縮體積至300 mL，后入乙醇（3倍體積）靜置過夜。次日依次經(jīng)離心沉淀，干燥凝集（初獲粗多糖），Sevag法（篩除蛋白成分），950 mL·L-1乙醇分級沉淀，高速離心收集沉淀，洗滌（依次使用無水乙醇、丙酮、乙醚），經(jīng)低溫干燥即為狗脊多糖。

2.2 苯酚-硫酸比色法檢測狗脊多糖的含量

2.2.1 最大吸收波長的選擇 先以50 mL蒸餾水為母液，混勻溶解準確稱取的無水葡萄糖0.01 g，重復上一步操作并以蒸餾水：無水葡萄糖為25 mL∶0.01 g的量值再次配制其混合液，此即為葡萄糖標準液。然后混勻含有0.1 mL（100 μL）葡萄糖標準液及0.9 mL（900 μL）蒸餾水的混合液，依次加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為5%的苯酚、5 mL濃硫酸后置于沸水15 min，冰水15 min反應，經(jīng)紫外分光儀檢測確定其最大吸收峰值波長。

2.2.2 葡萄糖標準曲線的制作 依次精密吸取葡萄糖標準液0.1，0.3，0.5，0.6，0.7，0.9，1.0 mL后分別加入7支試管中，加水稀釋至1.0 mL，依

次加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為5%的苯酚、5 mL濃硫酸后反應30 min。對比檢測空白對照組（蒸餾水）、葡萄糖標準液組在490 nm波長時的吸光度值（OD），分別以吸光度值A和葡萄糖質(zhì)量分數(shù)C（mg·mL-1）為縱橫標位，繪制標準曲線方程。

2.2.3 狗脊多糖的含量測定 先以50 mL蒸餾水為母液，混勻溶解準確稱取的狗脊多糖粉末0.01 g，重復上一步操作并以蒸餾水∶無水葡萄糖為25 mL∶0.01 g的量值再次配制其混合液，此即為狗脊多糖供試液。取供試液1.0 mL，依次加入1 mL苯酚（質(zhì)量分數(shù)5%）、5 mL濃硫酸反應后經(jīng)比色檢測其吸光度A，則狗脊多糖濃度C即可由標準曲線方程計算得出。

2.3 軟骨細胞的分離和培養(yǎng)及鑒定

2.3.1 軟骨細胞的分離和培養(yǎng) 其步驟依次為：人工處死大鼠每次3只（經(jīng)行脫頸錐式），浸泡消毒；離斷至雙側(cè)膝關(guān)節(jié)以上骨骼，PBS緩沖液沖洗凈，再次浸泡消毒；暴露關(guān)節(jié)腔，按層次分離關(guān)節(jié)軟骨，集中后經(jīng)剪碎處理（1 mm3/單位體積），PBS緩沖液沖洗3遍及以上，質(zhì)量分數(shù)為0.2%Ⅱ型膠原酶消化，無菌試管收集消化后的上清液（每次2 h，重復3次），高速離心后棄上清液；移液器代液（細胞培養(yǎng)液）狀態(tài)輕柔吹打沉淀，計數(shù)板計數(shù)（2×105·mL-1），種植原代細胞于培養(yǎng)瓶進行孵化培養(yǎng)；48 h后初次換液，鏡下觀察細胞鋪滿絕大數(shù)瓶底面積，PBS緩沖液沖洗倒凈，胰酶消化進行傳代培養(yǎng)，此時標為第1代軟骨細胞。以同樣方法傳至第3代細胞，鏡下觀察比較分析后，選取狀態(tài)及活性最佳的第2代軟骨細胞進行后續(xù)實驗。

2.3.2 軟骨細胞鑒定 甲苯胺藍染色法：使用經(jīng)高壓蒸汽消毒后的齒鑷輕柔夾持無菌蓋玻片轉(zhuǎn)移至6孔板孔中央部，以其為載體培育軟骨細胞（計數(shù)2500個·mL-1），待爬片后，沖洗（PBS）3遍；固定30 min（質(zhì)量分數(shù)為4%中性多聚甲醛），再次沖洗（PBS）3遍；染色（1%甲苯胺藍）10 min，第3次沖洗（PBS）3遍；漂洗至無深藍色（蒸餾水），再漂洗（無水乙醇）1次，常溫風干后封片，觀察與鑒定（光學顯微鏡）。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色：使用經(jīng)高壓蒸汽消毒后的齒鑷輕柔夾持無菌蓋玻片轉(zhuǎn)移至6孔板孔中央部，以其為載體培育軟骨細胞（計數(shù)2500個·mL-1），待爬片后，沖洗（PBS）3遍；固定30 min（質(zhì)量分數(shù)為4 %中性多聚甲醛），再次沖洗（PBS）3遍；裂解（質(zhì)量分數(shù)為0.1 %破膜劑50 μL） 20 min，第3次沖洗（PBS）3遍；50 μLH2O2（質(zhì)量分數(shù)為3 %）反應20 min，第4次沖洗（PBS）3遍；封閉（質(zhì)量分數(shù)5 % BSA）30 min后，陽性組一抗反應過夜（Ⅱ型膠原1∶200），陰性組用PBS代替，第5次沖洗（PBS）3遍；50 μL體積二抗（羊抗兔1∶200）反應30 min，第6次沖洗（PBS）3遍；DAB浸潤玻片（每次50 μL）反應10 min，流水漂洗3遍（每次5 min），蘇木素復染，第7次沖洗（PBS）3遍；迅速返藍（質(zhì)量分數(shù)為5 %鹽酸乙醇溶液）2 s，常溫晾干，梯度酒精脫水，二甲苯透明梯度，封片（中性樹脂），觀察與鑒定（光學顯微鏡）。

2.4 退變軟骨細胞模型的復制 選取第2代軟骨細胞，經(jīng)計數(shù)后，調(diào)整細胞懸液計數(shù)為2×104·mL-1，使用移液槍將其接種于潔凈培養(yǎng)瓶（4 mL），放置于37 ℃培養(yǎng)箱中（體積分數(shù)為5%的CO2）進行孵育細胞，每隔24 h更換1次培養(yǎng)液，待軟骨細胞沿瓶壁生長占滿約90%的空間時，按本課題組前期造模方式[7]，加入1 mM SNP干預軟骨細胞24 h后成模。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附法測試SOD、NO、MDA的含量 選取第2代軟骨細胞，按每孔1×105個·mL-1的密度接種于潔凈6孔板，設置空白對照組、模型對照組、狗脊多糖組。空白對照組：向每孔加入DMEM（體積分數(shù)為10 %的胎牛血清）2 mL培養(yǎng)24 h后，換新每孔2 mL的DMEM液依次加入后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。模型對照組：每孔中加入1 mM（1000 ng·mL-1）SNP的培養(yǎng)基2 mL 作用24 h后，更換新含10 %胎牛血清的DMEM 2 mL繼續(xù)培養(yǎng)48 h。狗脊多糖組：孔中加入劑量為

1 mM（1000 ng·mL-1）的SNP的培養(yǎng)基2 mL作用24 h后更換為不同質(zhì)量分數(shù)的狗脊多糖2 mL（100，200，400，800 μg·mL-1） DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h（狗脊多糖的最佳時效-量效關(guān)系為48 h與200 μg·mL-1，依據(jù)前期研究[7]）。將各組細胞液收集到離心管，離心機以1500 r·min-1離心2次后收集上清液，依實驗所需進行分裝后儲存于-80 ℃冰箱備用。按照各指標試劑盒說明書，其中NO、SOD、MDA的定量檢測分別以硝酸還原酶法、黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）、硫代巴比妥法（TBA）進行操作。

2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，2組間比較采用t檢驗與單因素方差分析；計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 苯酚-硫酸比色法測定結(jié)果

3.1.1 最大吸收波長的確定 制備標準品溶液與空白對照組溶液，操作如前，經(jīng)紫外線200～800 nm范圍內(nèi)檢測，結(jié)果表明最大吸收波長為484 nm。

3.1.2 葡萄糖標準曲線繪制 標準曲線回歸方程為：Y = 0.0672 X + 0.0157，R2 = 0.9994，說明葡萄糖在1～11 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.3 精密度、穩(wěn)定性及加樣回收率試驗 精密度試驗：精密吸取標準品溶液0.5 mL，加蒸餾水至1.0 mL，按苯酚-硫酸法操作在最大吸收波長處平行測定6次，A值分別為0.443 8，0.432 9，0.439 6，0.442 9，0.438 2，0.422 0，RSD = 1.86%，表明儀器精密度良好。穩(wěn)定性試驗：精密吸取標準品溶液0.5 mL，加蒸餾水至1.0 mL，按苯酚-硫酸法操作，在最大吸收波長處每隔30 min測1次，共測6次，A值分別為0.423 6，0.432 3，0.419 6，0.421 9，0.409 2，0.412 0，RSD = 1.98 %。加樣回收率試驗：取樣品溶液6份，每份均為0.4 mL，依次向每份溶液中加入葡萄糖標準品溶液0.3 mL，加入蒸餾水至

1 mL，按苯酚-硫酸法操作，于484 nm處測定其吸光度，計算平均回收率為95.4 %，RSD = 1.83%。

3.1.4 狗脊多糖樣品含量測定 取供試液1.0 mL，使用移液槍加入質(zhì)量分數(shù)為5 %的苯酚1 mL進行混勻，再迅速緊貼管壁滴加5 mL濃硫酸，經(jīng)緩慢振蕩混勻，比色檢測吸光度A，由回歸方程求出經(jīng)Sevag法除蛋白后的狗脊多糖含量為76.91%。

3.2 軟骨細胞形態(tài)學特征及鑒定

3.2.1 軟骨細胞形態(tài)學特征 鏡下觀察細胞外觀形態(tài)近似圓形，大小基本一致，且遮光性強為原代軟骨細胞；接種24 h后大多數(shù)軟骨細胞開始緊貼壁生長，形似扁平狀，胞漿豐富，胞核清晰，具有1～2個核仁，見圖1（1）；培養(yǎng)3 d后，軟骨細胞開始聚集重疊并沿瓶壁擴散生長，呈現(xiàn)“簇團樣”集聚，外觀以圓形或橢圓形為主，見圖1（2）；5 d后細胞分布均勻，邊界清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，呈明顯的鋪路石狀外觀，見圖1（3）；本實驗使用第2代軟骨細胞因其生長狀態(tài)良好，細胞分泌基質(zhì)的能力較強，增殖速度較快，見圖1（4）。

3.2.2 甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組化鑒定結(jié)果 經(jīng)甲苯胺藍染色后，正常軟骨細胞鏡下顯示其細胞核被染成藍色，細胞間質(zhì)及胞漿均被染成紫紅色；經(jīng)Ⅱ型膠原染色后，陰性組胞漿區(qū)顏色透明，陽性組胞漿區(qū)為棕黃色，由上可鑒定本實驗所用細胞為軟骨細胞。見圖2。

3.3 酶聯(lián)免疫吸附測定法測試SOD、NO、MDA含量結(jié)果 200 μg·mL-1狗脊多糖作用于1mM SNP造模后的軟骨細胞，可通過上調(diào)SOD含量表達，同時下調(diào)NO、MDA含量表達。與空白對照組比較，模型對照組差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01），提示軟骨細胞在一定程度上發(fā)生退變，軟骨細胞退變模型建立；與模型對照組比較，各劑量狗脊多糖組差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01），提示狗脊多糖可通過改善退變模型軟骨細胞氧自由基表達來發(fā)揮抗氧化作用，進而在一定程度上延緩軟骨細胞的凋亡進程。見表1和圖3。

4 討 論

4.1 狗脊多糖切合KOA的中醫(yī)治療病機 從中醫(yī)辨證論治的角度看，KOA屬“膝骨痹”范疇，其病機多為肝腎不足引起筋骨失養(yǎng)，外加風寒濕邪流注經(jīng)絡，困乏關(guān)節(jié)，致使氣血運行受阻，引起關(guān)節(jié)活動受限，即其病位在“肝腎”，然病在“筋骨”，故對其治療的根本法則為補益肝腎、祛風除濕，從而發(fā)揮固其根本以壯筋骨、通利關(guān)節(jié)之效。金毛狗脊Cibotium barometz（L.）J.S簡稱為狗脊，其作為臨床治療骨關(guān)節(jié)炎的常用中藥材之一，入肝腎經(jīng)，具有補腎柔肝、益盛筋骨、祛風除濕作用，故從中醫(yī)角度，狗脊多糖切合骨關(guān)節(jié)炎本虛標實的病機[8-10]。

4.2 狗脊多糖干預KOA的機制 相關(guān)研究表明，關(guān)節(jié)內(nèi)氧自由基含量的異常表達可通過介導氧化反應引起軟骨細胞膜及胞內(nèi)線粒體正常結(jié)構(gòu)的破壞，這不僅影響細胞內(nèi)能量生成，阻礙基質(zhì)蛋白多糖與膠原的合成，同時也誘導細胞線粒體凋亡途徑發(fā)生，最終引起細胞發(fā)生自溶[11-13]。其中，對氧化反應的轉(zhuǎn)歸影響較大的因素主要有以MDA和NO為代表的促氧化因子和以SOD為主的抗氧化因子[14]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，狗脊多糖組與模型對照組比較，可顯著降低軟骨細胞液中MDA和NO的含量表達，并上調(diào)SOD的含量表達，其中尤其以200 μg·mL-1組效果顯著，進而提示狗脊多糖干預KOA的作用機制為通過降低經(jīng)硝普鈉造模后軟骨細胞中異常氧自由基含量表達，上調(diào)抗氧化因子水平，發(fā)揮抗氧化作用，這亦與前期研究結(jié)果相一致[7]，即經(jīng)狗脊多糖最佳時效-量效的48 h與200 μg·mL-1干預軟骨細胞后，可正向調(diào)控Cyclin D1、CDK4等蛋白與mRNA表達，其增殖機制為通過提高軟骨細胞周期中G1至Gs的轉(zhuǎn)變率未實現(xiàn)的。

綜上所述，鑒于狗脊多糖在干預KOA方面發(fā)揮特殊療效，故相關(guān)研究和科學工作仍需進一步開展。首先，對狗脊多糖中有效成分的進一步分離與純化，及其在治療KOA上的多通路、多靶點作用方面有待深入研究；其次，應進一步深入探究其對軟骨細胞凋亡及相關(guān)炎性通路或指標的影響，以擴寬其干預骨關(guān)節(jié)的視角?？傊?，通過對狗脊多糖進行內(nèi)涵與外延式的深入研究，逐步闡明其治療機制，最終發(fā)揮狗脊多糖在治療骨關(guān)節(jié)炎方面的多靶點、多功效的作用。

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