舞毒蛾的室內(nèi)人工大量飼養(yǎng)技術(shù)優(yōu)化1)

趙捷 王一鳴 左伊凡 石娟

(林木有害生物防治北京市重點實驗室(北京林業(yè)大學)，北京，100083)

余金勇 鄒元平 V. I. Ponomarev V. G. Bezborodov

(貴州省林業(yè)科學研究院) (內(nèi)蒙古大興安嶺林業(yè)管理局森防站) (Institute Botanical Garden) (Laboratory of Plant Protection)

舞毒蛾(Lymantriadispar(Linnaeus))隸屬于鱗翅目(Lepidoptera)裳蛾科(Erebidae)毒蛾亞科(Lymantriinae)毒蛾屬(Lymantria)，是一種雜食性食葉害蟲[1]，廣泛分布于歐亞大陸，包括歐洲大部分地區(qū)、地中海地區(qū)(含北非)、高加索山脈、亞洲溫帶地區(qū)等[2]。據(jù)趙仲苓報道，其寄主植物可達500余種[3]，其主要危害方式是在幼蟲期大量取食寄主樹葉，連續(xù)取食會導致被取食樹木樹勢衰弱甚至死亡[4-5]。美國政府在防治舞毒蛾方面每年累計花費大約八億六千萬美元，雖然花了大量的人力和物力，但是仍然無法根除。現(xiàn)在，歐州型舞毒蛾在美國東海岸已經(jīng)是對林業(yè)危害最大的昆蟲之一。

若要開展舞毒蛾遺傳多樣性、防治、抗藥性、生物學特性等方面的研究，需要室內(nèi)具備大量各發(fā)育階段的供試昆蟲，標準化、高效的人工飼養(yǎng)技術(shù)是各項研究得以順利進行的前提。昆蟲的人工飼養(yǎng)技術(shù)作為昆蟲學研究的基本技術(shù)之一，它不受季節(jié)、地區(qū)的限制，并能得到生理條件完全一致的昆蟲，高效和易行的室內(nèi)人工飼養(yǎng)有助于實驗室建立長期和大規(guī)模昆蟲種群，并可直接用于昆蟲生物學、營養(yǎng)生理、害蟲防治等研究[6]，而使許多學科如害蟲綜合防治得到迅速發(fā)展[7]。人工飼養(yǎng)的鱗翅目昆蟲已超556[8]種，此前王麗君[9]、王志英等[10]、曹利軍等[11]都對舞毒蛾的室內(nèi)人工飼養(yǎng)進行過研究，但大多集中在飼料的配方優(yōu)化上，缺乏對舞毒蛾飼養(yǎng)方法的系統(tǒng)性研究和介紹。鑒于此，本研究針對亞洲型及歐洲型舞毒蛾建立了一整套室內(nèi)人工飼養(yǎng)繁育技術(shù)，明確了其不同生長階段的飼養(yǎng)控制關(guān)鍵因子和因素，并重點從最影響舞毒蛾發(fā)育進度的幼蟲期飼養(yǎng)方式上進行了深度優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蟲源：中國內(nèi)蒙古地區(qū)舞毒蛾、山東地區(qū)舞毒蛾、希臘歐洲型舞毒蛾。

1.2 人工飼料煮制

人工飼料配方在參考前人的基礎(chǔ)上反復試驗調(diào)整而得。具體做法為：將小麥胚芽烘烤后粉碎，置于冰箱中4 ℃保存待用。以制備1 L飼料為例，準備純凈水900 mL、小麥胚芽250.00 g、酪蛋白25.00 g、韋氏鹽7.80 g、檸檬酸鐵0.21 g、山梨酸2.00 g、苯甲酸甲酯防腐劑1.00 g、抗壞血酸5.00 g、氯化膽堿0.58 g、肌醇0.35 g、葡萄糖20.00 g、范式維生素B。其中，范式維生素B配比參考曹利軍等[11]。

飼料原料準備好后，有如下2種具體制備方法：

1)普通煮制法(方法1)。小麥胚芽、酪蛋白、維生素混合物和鹽混合物保存在冰箱中，在煮制前從冰箱中取出預先稱質(zhì)量的飼料成分以適應(yīng)室溫。將小麥胚芽、蔗糖、酪蛋白，放入保鮮袋中充分混合均勻并標記混合物為1號。將稱(或量)取的抗壞血酸、肌醇、山梨酸、韋氏鹽、對羥基苯甲酸甲酯、范氏維生素B、氯化膽堿標記混合物為2號。將稱取好的瓊脂放入普通開水鍋中加蒸餾水煮沸后加入1號混合物，充分攪拌直到煮沸。停止加熱待其冷卻至60～70 ℃加入2號混合物，繼續(xù)手動攪拌5 min后分裝入果凍杯飼養(yǎng)器皿，使飼料覆蓋杯底且厚度達2 cm。待飼料冷卻凝固且水蒸汽完全逸散后蓋上杯蓋，整齊擺放于托盤后裝入保鮮袋放入4 ℃冰箱保存。

2)蒸汽鍋煮制法(方法2)。配料稱量備用方法同方法1。預先檢查水壓為負值后倒入900 mL的涼蒸餾水，在確保蒸汽鍋(Groen Table Top Steam Kettle TDB-24)中的水位在最低線以上后進行后續(xù)操作。將瓊脂倒入蒸餾水中加熱并打開攪拌器。當瓊脂水混合物剛剛開始沸騰時(水面邊緣出現(xiàn)氣泡約1 min)，緩慢加入1號混合物。在全部混合物煮沸后繼續(xù)加熱12 s，使其充分滅菌后停止加熱，此時飼料將繼續(xù)沸騰幾分鐘，繼續(xù)攪拌混合溶液5 min。在此期間需暫時關(guān)閉攪拌器以粉碎團塊，保證飼料各成分均勻混合。將2號混合物慢慢加入，使用攪拌器繼續(xù)攪拌5 min后分裝入果凍杯飼養(yǎng)器中，后續(xù)操作同方法1。

每個煮制方法制備飼料飼喂的幼蟲設(shè)3 個重復組，每組重復初孵幼蟲50頭。觀察并記錄供試蟲3齡幼蟲感病率、老熟幼蟲化蛹率、蛹質(zhì)量等生物學特性。

1.3 幼蟲孵化

為了研究幼蟲生長發(fā)育特性，實驗室有以下2種孵化幼蟲的方法：

1)卵塊直接孵化法。卵塊即將孵化時，對卵塊不作任何處理，置于方形培養(yǎng)皿中后置于培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)，等待其孵化。

2)紗布分離絨毛覆蓋物法。將滅菌后的紗布折疊為信封狀并用訂書機固定，把即將孵化的卵塊放入其中，共同置于方形培養(yǎng)皿中等待其孵化。待幼蟲孵化后初孵幼蟲會從紗布孔洞中鉆出，在此過程中可將幼蟲與體表附著的卵塊絨毛分離。

3個舞毒蛾種群分別用2種孵化法處理，每個孵化處理方法設(shè)3個重復，每重復約100 粒卵。觀察并統(tǒng)計不同處理下初孵幼蟲生長至3齡的感病率。

1.4 3齡及以上幼蟲的飼養(yǎng)

舞毒蛾幼蟲3齡前體型微小且食量較小，此階段使用方形培養(yǎng)皿作為飼養(yǎng)容器較合適。具體操作為，將飼料切割置于方形培養(yǎng)皿，將初孵幼蟲用小毛刷挑取放入并根據(jù)取食情況更換飼料塊。在舞毒蛾進入蛹期后，根據(jù)蛹體大小判斷其性別，以雌雄比1∶3～1∶5 的比例分配至紙盒，為舞毒蛾羽化交配做準備。紙盒蓋用80 目防蟲網(wǎng)代替，以防羽化舞毒蛾逃逸。飼養(yǎng)各齡期舞毒蛾的人工氣候箱溫度設(shè)定在(26 ±1)℃，光周期為12 h /12 h (光照/黑暗) 。

在舞毒蛾幼蟲飼養(yǎng)過程中，應(yīng)用3種飼養(yǎng)器具對3齡以上舞毒蛾幼蟲進行飼養(yǎng)。

1)方形培養(yǎng)皿。將供試3齡幼蟲每5頭分為一組。使用小毛刷挑取一組幼蟲后，放入經(jīng)過滅菌處理后的方形培養(yǎng)皿，在挑取轉(zhuǎn)移過程中，要注意使用消毒液消毒毛刷，防止將菌帶入或致使幼蟲間交叉感染(圖1a)。

2)氣窗式塑料果凍杯。將裝有飼料的果凍杯作為飼養(yǎng)器皿，移除原杯蓋，杯蓋上用80 目防蟲網(wǎng)制作一個邊長1 cm 的方形通氣窗[11]。飼養(yǎng)過程保持果凍杯正置狀態(tài)。將供試3齡幼蟲每5頭分為一組轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)器皿中(圖1b)。

3)鉆孔式塑料果凍杯。將裝有飼料的果凍杯作為飼養(yǎng)器皿，用細錐由外向內(nèi)在杯壁上扎孔約20個，放置于實驗室至室溫后去除水汽備用。將供試3齡幼蟲每5頭分為一組，用小毛刷挑取5頭幼蟲后放入果凍杯后，將果凍杯倒置，使飼料所在的杯底在上方，幼蟲糞便落入下方的杯蓋(圖1c)。

觀察記錄老熟幼蟲的歷期、化蛹率、蛹質(zhì)量和羽化率4個生物學指標。每處理重復3 次，每重復100頭初孵幼蟲。

圖1 舞毒蛾幼蟲飼養(yǎng)器具

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Duncan極差法進行處理，分析各處理生物學特性的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工飼料煮制方法對舞毒蛾幼蟲生長的影響

由表1可見：喂食不同煮制方法的人工飼料，舞毒蛾幼蟲在感病率、化蛹率、蛹質(zhì)量3個指標上均差異顯著。其中，使用蒸汽鍋煮制的飼料飼喂的幼蟲在3個舞毒蛾種群中的感病率均較低、化蛹率和蛹質(zhì)量都較高。

2.2 幼蟲孵化方法對幼蟲生長的影響

由表2可見：對于3個舞毒蛾種群，使用紗布分離絨毛覆蓋物法均可顯著提高幼蟲存活率，降低其感病率。

表1 飼料煮制方法對舞毒蛾生物學指標的影響

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；同一種群，不同煮制方法數(shù)據(jù)后字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表2 幼蟲孵化方法對舞毒蛾3齡幼蟲感病率的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；同一種群，不同孵化方法的數(shù)據(jù)后字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 不同飼養(yǎng)器皿對3齡及以上幼蟲生長的影響

由表3可見：對于幼蟲兩個指標而言，在3種容器飼養(yǎng)的3個種群舞毒蛾的幼蟲歷期和羽化率間差異均不顯著。使用方形培養(yǎng)皿和氣窗式塑料果凍杯飼養(yǎng)幼蟲時，幼蟲的化蛹率和蛹質(zhì)量顯著小于使用鉆孔式塑料果凍杯的。綜合分析可知，以鉆孔式塑料果凍杯飼養(yǎng)舞毒蛾幼蟲的效果最好。

表3 幼蟲飼養(yǎng)器皿對舞毒蛾幼蟲生物學指標的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；同一種群，不同飼養(yǎng)器皿處理數(shù)據(jù)后字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，飼喂舞毒蛾過程中，飼料經(jīng)蒸汽鍋煮制后，相比普通煮制法能顯著減少供試的3個舞毒蛾種群幼蟲的感病率，其化蛹率和蛹質(zhì)量也顯著增加。此外，以紗布分離絨毛覆蓋物法處理初孵幼蟲這一措施，可增加初孵幼蟲的成活率、降低感病率。不同飼養(yǎng)器皿對3齡及以上幼蟲生長的影響試驗發(fā)現(xiàn)，對于供試的3個種群，鉆孔塑料果凍杯飼養(yǎng)的幼蟲生長情況較好，其化蛹率和蛹質(zhì)量顯著高于方形培養(yǎng)皿及氣窗式塑料果凍杯，3種器皿飼養(yǎng)后老熟幼蟲羽化率、幼蟲歷期并無明顯變化。

很多鱗翅目的幼蟲都易感染病毒，在鱗翅目飼養(yǎng)過程中抑制細菌病毒的滋生是飼養(yǎng)的重要事項[12]，要成功人工室內(nèi)飼養(yǎng)昆蟲，主要從卵面消毒，配制無菌飼料和消毒養(yǎng)蟲工具三方面進行[13]。本研究也主要從這三方面入手。野外采集的卵塊室內(nèi)馴化飼養(yǎng)前需進行消毒處理：使用消毒紙巾將卵塊反復揉搓，使得卵塊與表面覆蓋絨毛剝離，后用干凈紗布包裹浸泡于甲醛消毒液中消毒。

試驗中對初孵幼蟲進行網(wǎng)紗剝離絨毛處理，可以有效去除絨毛，防止絨毛上沾染的細菌直接感染幼蟲或污染飼料，影響舞毒蛾幼蟲的生長發(fā)育。相對普通烹飪器皿而言，蒸汽鍋可對飼料進行徹底的高溫高壓滅菌，可有效延長飼料保藏時間并減少飼料滋生細菌。同時先進的電子控制裝置降低了鍋內(nèi)溫度變化從而提高煮制飼料的質(zhì)量和一致性。在整個飼養(yǎng)過程中，各環(huán)節(jié)使用的實驗器具需高溫或紫外消毒。更換飼料工作需在生物安全柜內(nèi)進行，保證了操作過程的無菌環(huán)境。養(yǎng)蟲室內(nèi)和培養(yǎng)箱內(nèi)定期噴灑消毒液，抑制箱內(nèi)的菌類生長。養(yǎng)蟲杯中一旦發(fā)現(xiàn)病蟲后就應(yīng)全部銷毀，以免傳染其它試蟲而造成更大損失。

使用鉆孔塑料果凍杯飼養(yǎng)幼蟲有諸多優(yōu)點：果凍杯打孔不僅有利于幼蟲飼養(yǎng)環(huán)境透氣干燥，并且打孔產(chǎn)生的凸起有利于幫助幼蟲攀附于杯壁上而與飼料和糞便隔離，果凍杯倒置也可有效分離飼料與糞便，最大限度維持幼蟲生存環(huán)境的整潔，防止糞便污染飼料滋生病毒細菌。果凍杯飼養(yǎng)幼蟲期間應(yīng)根據(jù)飼料及幼蟲生長情況及時更換盛裝飼料的果凍杯。老熟幼蟲的飼養(yǎng)方法與之類似，只是因老熟幼蟲體型較大，每個果凍杯視其體型放置1～2頭幼蟲即可。果凍杯飼養(yǎng)幼蟲期間應(yīng)根據(jù)飼料及幼蟲生長狀況，及時更換裝有飼料的果凍杯，老熟幼蟲要格外注意殺菌消毒工作，直至幼蟲化蛹。

本研究首次引入歐洲型舞毒蛾為供試蟲，試驗證明飼養(yǎng)亞洲型舞毒蛾方法同樣適用于歐洲型舞毒蛾。試驗中觀察到：歐洲型舞毒蛾體型較小吐絲結(jié)網(wǎng)量較亞洲舞毒蛾稍大，應(yīng)適當降低飼養(yǎng)密度，以減少因絲網(wǎng)造成的幼蟲死亡。此方法飼養(yǎng)的舞毒蛾可獲得大量齡期較一致幼蟲，而且不受林間復雜的環(huán)境條件影響，飼養(yǎng)方法簡單易行，可實現(xiàn)無間斷連續(xù)室內(nèi)飼養(yǎng)。