1株木霉的分離鑒定及抑菌和植物促生作用1)

潘宣圳 曾曉春 劉偉璐 劉志華 王金杰 范海娟

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

木霉菌無性階段為木霉屬(Trichoderma)，有性階段為肉座菌屬(Hypocrea)[1]，廣泛存在于多種生態(tài)系統(tǒng)中[2]。大多數(shù)木霉菌具有生長(zhǎng)迅速，適應(yīng)能力強(qiáng)，環(huán)境友好的特點(diǎn)。目前已經(jīng)報(bào)道的木霉菌有250多種[3]，包含許多對(duì)農(nóng)林業(yè)發(fā)展非常重要的植物病害生物防治菌，譬如哈茨木霉(T.harzianum)、棘孢木霉(T.asperellum)、深綠木霉(T.atroviride)、綠木霉(T.virens)等。生防木霉菌通過競(jìng)爭(zhēng)、抗生、重寄生和誘導(dǎo)植物抗性等多種機(jī)制對(duì)至少18個(gè)屬29種植物病原真菌有拮抗作用[4]。生防木霉不僅可用于植物生長(zhǎng)期病害防護(hù)，也可用于果蔬及園林植物材料的儲(chǔ)運(yùn)保鮮和儲(chǔ)藏期病害防護(hù)[5-6]。在抗病的同時(shí)，生防木霉還能促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高土壤肥力[1,7]。所以，木霉資源的收集鑒定及生防能力測(cè)試對(duì)生防木霉的開發(fā)應(yīng)用具重要價(jià)值。小白菜(Brassicachinensis)是十字花科蕓薹屬蔬菜，營(yíng)養(yǎng)豐富，生長(zhǎng)周期短，是非常適合東北種植的設(shè)施蔬菜。種植過程中，病害、化肥超量施用、農(nóng)藥殘留、重金屬污染都會(huì)降低其品質(zhì)并影響其生長(zhǎng)速度。而木霉能改善小白菜品質(zhì)，同時(shí)也促進(jìn)其生長(zhǎng)[8-10]。本研究將哈爾濱本地分離的1株木霉，經(jīng)平板抑菌檢測(cè)后固體發(fā)酵，探索其對(duì)小白菜的促生長(zhǎng)作用，旨在開發(fā)一種東北地區(qū)適用的促小白菜生長(zhǎng)的木霉菌劑。

1 材料與方法

1.1 菌株及植物材料

以東北林業(yè)大學(xué)城市林業(yè)示范基地野生益母草(Leonurusjaponicus)根際土為材料進(jìn)行木霉分離。拮抗指示菌楊葉枯病菌(Alternariaalternata)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、楊樹爛皮病菌(Cytosporachrysosperma)由東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院保存。小白菜種子由甘肅武威市蔬菜種苗研究所育種。

1.2 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5.00 g，葡萄糖10.00 g，磷酸二氫鉀1.00 g，硫酸鎂(無水)0.50 g，瓊脂20.00 g，孟加拉紅0.03 g，氯霉素0.10 g，蒸餾水1 L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

PD培養(yǎng)基：PDA中不加瓊脂。

Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH值為7.4～7.6，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基：LB中不加瓊脂。

1.3 木霉的分離鑒定

采集益母草根際土樣[11]，系列稀釋后涂布于無菌孟加拉紅平板。28 ℃培養(yǎng)3 d后，挑取其上疑似木霉的單孢菌落，轉(zhuǎn)接到PDA斜面，28 ℃培養(yǎng)7 d后，置于冰箱中4 ℃保存，菌株縮寫為L(zhǎng)j。

將純化的Lj轉(zhuǎn)接到PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)，觀察描述菌落特征、生長(zhǎng)速度。另，采用插片法[12]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

將Lj孢子接入PD培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，過濾收集菌絲體。用CTAB法提取菌絲體DNA，PCR擴(kuò)增其ITS序列[13]。純化后ITS連入pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞。挑單克隆LB液體培養(yǎng)，PCR驗(yàn)證為陽性后送上海生工測(cè)序。所得序列用TrichOKEY[14]和TrichoBLAST[15]在線軟件進(jìn)行木霉鑒定。

1.4 木霉Lj菌株對(duì)植物病原真菌的抑制作用檢測(cè)

在Lj和供試植物病原真菌的PDA平板分別打孔獲得菌餅(d=5 mm)，轉(zhuǎn)接到新鋪制的PDA平板，二者相距6 cm，分別以每皿接種1和2個(gè)植物病原真菌菌餅的平板為對(duì)照1和對(duì)照2。每個(gè)試驗(yàn)6次重復(fù)，接菌后平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測(cè)量植物病原菌菌落半徑，計(jì)算抑菌率[12]。

1.5 木霉Lj菌株對(duì)小白菜促生作用測(cè)定

對(duì)Lj進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵[16]，產(chǎn)物用自來水稀釋，孢子濃度為109、108、107、106個(gè)·mL-1，分別灌土后播種催芽2 h的小白菜，以澆灌等量自來水的小白菜為對(duì)照，每濃度3個(gè)重復(fù)。在播種后15、30、45 d測(cè)小白菜葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量。取15 d第1、2真葉，30 d第3真葉，45 d第5真葉，蒸餾水洗凈吸干表面水份后-80 ℃凍藏，用以測(cè)定葉綠素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)和過氧化物酶(POD)活性。葉綠素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)和POD活性檢測(cè)均使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒。

數(shù)據(jù)分析時(shí)，葉綠素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)和POD活性的結(jié)果為3個(gè)樣每樣3次重復(fù)的平均值，其他指標(biāo)的結(jié)果為30株苗(10株/重復(fù)×3次重復(fù))的平均值。用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行處理間的差異顯著性分析，Duncan法進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉的分離純化

孟加拉紅培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)3 d時(shí)，白色菌絲形成疑似木霉的菌落(圖1Aa、圖1Ab)。挑取菌絲到PDA斜面，28 ℃培養(yǎng)2 d，獲得純化的Lj菌株(圖1Bc)。培養(yǎng)7 d，產(chǎn)生大量綠色分生孢子(圖1Bd)。

A.孟加拉紅培養(yǎng)基；B.PDA培養(yǎng)基；a.培養(yǎng)3 d(正面)；b.培養(yǎng)3 d(背面)；c.培養(yǎng)2 d；d.培養(yǎng)7 d。

2.2 木霉Lj菌株的形態(tài)

28 ℃ PDA平板培養(yǎng)3 d，菌落直徑約為90 mm，菌絲白色、叢毛狀。產(chǎn)孢簇外觀絨狀，培養(yǎng)3 d產(chǎn)孢區(qū)為黃綠色(圖2a)，培養(yǎng)7 d為暗黑綠色(圖2b)。菌絲寬度為1～9 μm，分枝多呈銳角，少數(shù)近直角(圖2c)。分生孢子梗直徑6～9 μm，常有2～3次分枝，近基部的分枝一般成對(duì)，而近頂部的分枝一般單生或?qū)ι?。分生孢子瓶梗安瓿形，具?xì)而短的頸部，排列成輪枝狀或排列不規(guī)則。分生孢子橢圓形，長(zhǎng)3～4 μm，寬1.5～2.5 μm，壁薄而光滑，單個(gè)時(shí)淺灰色，聚集時(shí)灰綠色(圖2d、圖2e)。其形態(tài)基本與毛簇木霉(T.velutinum)[17]236-238一致。

a、b.純化后Lj菌株(3 d和7 d)；c.菌絲(2 d)；d、e.分生孢子及分生孢子梗(7 d)。

2.3 木霉Lj菌株的ITS鑒定

以菌株Lj菌絲體基因組DNA(圖3a)為模板，PCR擴(kuò)增其ITS序列，序列大小為500～750 bp(圖3b)。將該P(yáng)CR產(chǎn)物切膠純化(圖3c)后進(jìn)行TA克隆，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗(yàn)證，確認(rèn)陽性克隆(圖3d)，測(cè)序得到ITS基因序列，長(zhǎng)度約620 bp。該序列的GenBank接受號(hào)為MG386272。經(jīng)TrichOKEY和TrichoBLAST分析ITS序列，Lj被鑒定為毛簇木霉。

a.菌絲體基因組DNA；b.ITS序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；c.純化后的ITS序列；d.ITS序列TA克隆的PCR驗(yàn)證(M為DL 2000 marker)。

2.4 木霉Lj菌株對(duì)植物病原真菌的拮抗效果

木霉菌株Lj對(duì)供試的3種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)有顯著的抑制效果(圖4)。對(duì)峙培養(yǎng)5 d后，與對(duì)照1相比，木霉菌株Lj對(duì)A.alternata、F.oxysporum和C.chrysosperma抑制率為(44.56±1.79)%、(37.51±3.03)%和(60.90±1.07)%，與對(duì)照2相比，抑制率分別為(38.39±1.91)%、(28.40±3.05)%、(52.63±1.43)%。抑菌率為6次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

A.A.alternata；B.F.oxysporum；C.C.chrysosperma；a、d、g.對(duì)照1；b、e、h.對(duì)照2；c、f、i.Lj與植物病原真菌的對(duì)峙。

圖4木霉Lj菌株對(duì)植物病原真菌的拮抗效果

2.5 木霉Lj菌株對(duì)小白菜的促生作用

植物葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與植物的光合作用、營(yíng)養(yǎng)狀況密切相關(guān)，是反映植物生長(zhǎng)狀況的重要指標(biāo)。而POD廣泛存在于植物細(xì)胞中，能夠消除過氧化氫和酚類、胺類對(duì)植物的毒性[18]。

由圖5、6可見，各時(shí)段木霉處理組小白菜的生長(zhǎng)狀態(tài)均好于對(duì)照組。由表1可見，處理組小白菜的葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)和鮮質(zhì)量在播種后15 d和30 d均明顯大于對(duì)照組。相應(yīng)地，處理組小白菜的葉綠素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于對(duì)照，各時(shí)段均表現(xiàn)為隨Lj孢子濃度下降而增加，并在106個(gè)·mL-1組最高(表2)。葉POD活性在15 d時(shí)與對(duì)照無顯著差異，30 d和45 d時(shí)大部分處理組顯著高于對(duì)照，分別在109和106個(gè)·mL-1組最高(表2)。可見，木霉對(duì)小白菜有前期促生長(zhǎng)和后期提高POD活性的作用。

A.處理15 d；B.處理30 d；C.處理45 d；a、f、k.對(duì)照；b、g、l.孢子濃度為1×109個(gè)·mL-1；c、h、m.孢子濃度為1×108個(gè)·mL-1；d、i、n.孢子濃度為1×107個(gè)·mL-1；e、j、o.孢子濃度為1×106個(gè)·mL-1。

圖5木霉Lj菌株處理后小白菜的總體生長(zhǎng)狀況

3 結(jié)論與討論

有些廣泛存在且重要的木霉至今未發(fā)現(xiàn)有性型[19]，而已知有性型的木霉種也很難人工培養(yǎng)獲得有性階段子實(shí)體，所以目前最常用的Gams & Bissett木霉分類系統(tǒng)仍以無性階段特征為分類依據(jù)[20]。但木霉無性型在形態(tài)學(xué)上存在漸變現(xiàn)象[17]26，實(shí)際應(yīng)用中按形態(tài)特征分類不好把握，所以木霉分類常用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法。ITS序列分析是木霉分類鑒定中較常用的簡(jiǎn)便快速而且準(zhǔn)確的方法[17]57-59。經(jīng)形態(tài)鑒定和ITS序列分析，菌株Lj被一致鑒定為毛簇木霉(T.velutinum)。

A.處理15 d；B.處理30 d；C.處理45 d；a-c.對(duì)照；d-f.孢子濃度為1×109個(gè)·mL-1；g-i.孢子濃度為1×108個(gè)·mL-1；j-l.孢子濃度為1×107個(gè)·mL-1；m-o.孢子濃度為1×106個(gè)·mL-1。

圖6 木霉Lj菌株處理后小白菜的個(gè)體生長(zhǎng)狀況

注：表中數(shù)據(jù)為30株苗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表2 木霉Lj菌株處理對(duì)小白菜葉綠素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)及POD活性的影響

注：表中的數(shù)據(jù)為3個(gè)樣每樣3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

毛簇木霉已在我國(guó)廣東、四川、山東、河南等省份的土壤中分離到[21-22]。該種在印度也被發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是嗜冷真菌[23]，能產(chǎn)生非核糖體肽和細(xì)胞壁降解酶，可作為生防制劑[24]。對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)毛簇木霉對(duì)煙草疫霉菌(Phytophthoraparasiticavar．nicotianae)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、楊葉枯病菌(A.alternata)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)有拮抗作用[22,24]。與前人研究結(jié)果相似的是，本研究也發(fā)現(xiàn)毛簇木霉Lj對(duì)尖孢鐮刀菌、楊葉枯病菌和楊樹爛皮病菌(C.chrysosperma)具較強(qiáng)拮抗作用。而且，3種植物病原菌中，對(duì)楊樹爛皮病菌的拮抗作用最強(qiáng)，抑菌率可達(dá)60.9%。認(rèn)為毛簇木霉Lj菌株可開發(fā)為生防制劑。

Zachow et al.發(fā)現(xiàn)毛簇木霉能在甜菜根表面和根內(nèi)定植，同時(shí)處理組甜菜葉長(zhǎng)顯著大于對(duì)照組[25]。本研究發(fā)現(xiàn)毛簇木霉菌肥施用于小白菜后，30 d內(nèi)處理組植株根長(zhǎng)、葉長(zhǎng)和鮮質(zhì)量明顯高于對(duì)照組，相應(yīng)的小白菜葉綠素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著較高，施肥最適濃度為106個(gè)·mL-1。可見，毛簇木霉Lj菌肥一次施用對(duì)小白菜生長(zhǎng)的促進(jìn)作用至少可持續(xù)30 d。預(yù)期該菌肥在設(shè)施小白菜的增產(chǎn)方面具有一定應(yīng)用價(jià)值。

已報(bào)道木霉促植物生長(zhǎng)主要途徑為代謝產(chǎn)物的促生作用，與促生根際微生物的有益互作，以及促進(jìn)土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放等方面[25-26]。而毛簇木霉菌株Lj對(duì)小白菜的促生作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

木霉促植物生長(zhǎng)的過程往往伴隨著植物防御酶活性的增加和植物抗逆能力的提升。植物過氧化物酶(POD)是重要的解毒酶之一，可降低逆境對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，其活性與植物抗逆能力密切相關(guān)[18]。本研究中，小白菜葉片POD活性在30 d和45 d時(shí)大部分處理顯著高于對(duì)照，分別在109、106個(gè)·mL-1組最高。毛簇木霉菌肥的處理可能有助于提高生長(zhǎng)后期小白菜植株的抗逆能力。由于植物光合作用、次生代謝產(chǎn)物合成、脅迫條件的變化均可能影響抗氧化酶活性，使之產(chǎn)生非線性的變化[27]，本研究中取樣點(diǎn)較少，時(shí)間間隔較長(zhǎng)，可能無法找到POD變化的拐點(diǎn)，不能精確反映其變化規(guī)律。