PHBV/葡聚糖納米藥物載體的制備及表征

劉海蓉 張清卿 周征 胡薏冰 張水寒 戴瑤 李永生

摘 要：兩親性聚合物納米顆粒作為疏水性抗腫瘤藥物載體因其能夠增強(qiáng)化療效率并降低毒副作用而受到廣泛關(guān)注.采用雙乳液溶劑揮發(fā)法制備了聚（3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯）（PHBV）/葡聚糖納米顆粒，測得平均粒徑為205.0±6.9 nm， Zeta電勢為-1.59±0.12 mV，納米顆粒具有明顯的殼核結(jié)構(gòu)，粒徑均一，分散性良好.將疏水性化療藥物順鉑包載后，其粒徑及電勢均無明顯變化，載藥量達(dá)19.3±2.9%.順鉑在模擬腫瘤細(xì)胞環(huán)境pH=5.5的磷酸鹽緩沖液（PBS）中比正常細(xì)胞環(huán)境pH=7.4時(shí)釋放更快，且累計(jì)釋放周期均長達(dá)7 d以上，表明該藥物載體具有一定的pH響應(yīng)性以及優(yōu)異的緩釋性能.細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)表明PHBV/葡聚糖納米藥物載體具有良好的生物相容性，而載藥納米顆粒對腫瘤細(xì)胞的毒性明顯高于正常細(xì)胞，表明該納米顆粒對腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作用.綜上所述，PHBV/葡聚糖納米顆粒具有兩親性分子結(jié)構(gòu)，合適的粒徑及Zeta電勢，顯著的緩釋效果，對腫瘤細(xì)胞具有pH響應(yīng)性及更強(qiáng)的殺傷作用等優(yōu)勢，有望成為一種新型納米藥物載體，在癌癥化療中顯著提高藥物利用率并降低毒副作用.

關(guān)鍵詞：PHBV；葡聚糖；納米顆粒；藥物載體；體外藥物釋放；細(xì)胞毒性

中圖分類號：R943； O636文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract：Amphiphilic polymer nanoparticles have attracted considerable attention especially as anticancer drug delivery system， since they can enhance bioavailability and reduce side effects of drugs used for chemotherapy. Novel poly （3-hydroxybutyric-co-3-hydroxyvaleric， PHBV）/dextran nanoparticles （PDNPs） drug delivery system was formulated via an original double emulsion （w1/o1/w2） solvent-evaporation method. The mean diameter of PDNPs was 205.0±6.9 nm and their zeta potential was -1.59±0.12 mV by using dynamic light scattering （DLS） detection. PDNPs showed obvious core-shell structure with uniform particle dispersion. Cisplatin， as a model anticancer drug， was loaded to demonstrate the characterizations of the drug delivery system， and its loading did not significantly alter the hydrodynamic diameter and zeta potential of nanoparticles with 19.3±2.9% of drug loading content （DLC）.In-vitro drug release profile of cisplatin from cisplatin-loaded PDNPs found that it can be released faster in normal cells （pH=7.4） than cancer cells （pH=5.5） in phosphate buffered saline （PBS）， and the release period was more than 7 d，which demonstrated that this drug delivery system was pH-responsive and with excellent slow-release performance. PDNPs displayed no cytotoxicity， and cisplatin-loaded PDNPs exhibited higher killing efficient to cancer cells when compared with normal cells， which indicated this nano-delivery system can kill cancer cells more effectively.Thus， the novel PDNPs drug delivery system can be potentially applied for cancer chemotherapy， which will improve the utilization ratio and reduce side effect of drugsin the cancer chemotherapy.

Key words： PHBV； dextran； nanoparticles； drug delivery system； drug release in vitro； cytotoxicity

隨著藥物載體的發(fā)展，兩親性聚合物納米顆粒作為抗腫瘤化療藥物載體的研究受到廣泛關(guān)注[1-2]，兩親性聚合物納米藥物載體具有以下優(yōu)勢：將疏水性藥物有效包載從而提高藥物在水溶液中的溶解度，同時(shí)避免傳統(tǒng)復(fù)合溶媒或增溶劑產(chǎn)生的毒副作用[3]；表面親水性可防止納米顆粒被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)識別排異從而延長藥物體內(nèi)循環(huán)時(shí)間[1，2，4-5]；通過腫瘤組織特有的高滲透及滯留效應(yīng)（Enhanced Permeation Retention effect， EPR）[6]被動(dòng)靶向到腫瘤組織，增加腫瘤部位血藥濃度；通過聚合物載體的降解將藥物緩慢釋放，有效避免藥物突釋現(xiàn)象并延長藥物作用時(shí)間，從而提高化療藥物的治療效率，降低體內(nèi)非特異性藥物分布從而減輕對正常組織的傷害，降低毒副作用[7].

藥物載體材料必須具有良好的生物相容性，生物可降解性及進(jìn)入血液循環(huán)后相對穩(wěn)定的物理性質(zhì)[8].常用的藥物載體材料包括聚己內(nèi)酯，多糖，聚丙烯酸，聚羥基脂肪酸等[5].聚（3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯）（Poly （3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate）， PHBV）是由原核微生物合成的天然高分子共聚物，具有良好的生物相容性及生物可降解性[9]，廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物載體系統(tǒng)[10-11]及生物材料領(lǐng)域[12-13].Cristian Vilos等[10]將PHBV用于構(gòu)建疏水性化療藥物紫杉醇的納米載體，并通過分子動(dòng)力學(xué)方法模擬PHBV的降解過程從而解釋了紫杉醇在PHBV中的緩釋行為.Farha Masood等[11]研究表明將化療藥物玫瑰樹堿包載于PHBV納米顆粒后較游離藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用顯著增強(qiáng)，化療效率明顯提高.然而在血液循環(huán)過程中，疏水性的物質(zhì)易與調(diào)理素結(jié)合，并被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識別排異[1]，為了提高PHBV的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，使其到達(dá)腫瘤組織，在PHBV表面包覆一層親水性物質(zhì)成為一種很好的策略.葡聚糖是由多個(gè)以α-（1→6）鍵合的葡萄糖分子聚合而成的低聚糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性和無免疫原性，作為血漿替代品至今超過五十年，也是注射用藥的成分之一，且葡聚糖本身不帶電荷[5，7，12，14]，在藥物載體領(lǐng)域受到廣泛研究.

抗腫瘤化療藥物以疏水性藥物居多，如常用的順鉑，紫杉醇，阿霉素等.臨床化療方案中順鉑的使用頻率超過50%.順鉑具有較強(qiáng)的廣譜抗癌作用，但其毒副作用明顯，如腎毒性、耳毒性、神經(jīng)毒性等，且容易與其他藥物產(chǎn)生交叉耐藥性.用藥物載體將其包載后，可增加其溶解度，被動(dòng)靶向到腫瘤組織以提高藥效，降低正常組織中的藥物分布從而降低毒副作用[15-16].

本文采用雙乳液溶劑揮發(fā)法制備了PHBV/葡聚糖納米藥物載體，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化納米顆粒粒徑制備參數(shù)，對其成分、粒徑、Zeta電勢、形貌以及生物相容性進(jìn)行表征后，通過分子間疏水作用將化療藥物順鉑包載其中，通過對載藥量、包封率、體外模擬藥物累計(jì)釋放效率，以及載藥納米顆粒對正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的毒性進(jìn)行表征，以此評估PHBV/葡聚糖納米顆粒作為藥物載體在癌癥化療中的應(yīng)用前景.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

PHBV（Mw=300 000， 3%HV），寧波天安生物材料有限公司，結(jié)構(gòu)式見圖1（a）；葡聚糖（Mw=20 000），生化試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，結(jié)構(gòu)式見圖1（b）；聚乙烯醇124（PVA， Mw=105 000），分析純，西隴化工股份有限公司；二氯甲烷（CH2Cl2），分析純，天津市富起化工有限公司；丙酮，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；順鉑（>99%），武漢紐拜爾醫(yī)藥科技有限公司；甲醇，生工生物工程股份有限公司；DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基，胎牛血清，Gibco； RPMI 1640培養(yǎng)基，Hyclone；雙抗（青霉素和鏈霉素），胰蛋白酶，結(jié)晶紫，北京鼎國生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿，Greiner bio-one.

電子天平，F(xiàn)A1104，上海天平儀器廠；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，DF-101S，廣州市星爍儀器有限公司；超聲波細(xì)胞破碎儀，SM-150D，南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司；傅里葉紅外光譜儀，Nexus，Thermo Nicolet；納米粒徑及Zeta電位儀，Nano-ZS，Malvern；透射電子顯微鏡，Tecnai G2 F20，F(xiàn)EI；高效液相色譜儀（HPLC），Agilent 2000，American；萬能倒置顯微鏡，IX71，OLYMPUS；生物安全柜，HF-1200，中國力新發(fā)展有限公司；CO2培養(yǎng)箱，BB15，Thermo.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 PHBV/葡聚糖納米顆粒的制備

采用新型雙乳液溶劑揮發(fā)法制備PHBV/葡聚糖納米顆粒，該方法操作簡單，無有毒試劑殘留，粒徑易于控制，且納米顆粒收率較高，是一種理想的納米藥物載體制備方法.

將PHBV加入二氯甲烷中，63 oC恒溫水浴10 min使其溶解.將10 mg/mL葡聚糖水溶液與一定量的丙酮混合均勻，然后以1∶3體積比加入PHBV/二氯甲烷溶液，在冰浴條件下超聲破碎形成初乳（w1/o1）（超聲參數(shù)：功率120 W，工作時(shí)間2 s，間隔時(shí)間3 s，超聲時(shí)長5 min）再按1∶3體積比加入5 mg/mL的PVA水溶液，超聲破碎形成復(fù)乳（w1/o1/w2），最后將復(fù)乳倒入一定體積0.5 mg/mL PVA水溶液中，緩慢攪拌直至有機(jī)溶劑揮發(fā)完全，通過進(jìn)一步離心、洗滌、重懸，得到分散在水中的PHBV/葡聚糖納米顆粒.

1.2.2 順鉑藥物包封實(shí)驗(yàn)

通過分子間疏水作用將順鉑包封于PHBV/葡聚糖納米顆粒的疏水內(nèi)核中，具體操作如下：在PHBV/葡聚糖納米顆粒的制備過程中，將順鉑加入葡聚糖水溶液加熱使其溶解，再與丙酮混合均勻后與PHBV/二氯甲烷溶液混合超聲形成初乳，后期實(shí)驗(yàn)步驟同上.

1.2.3 順鉑藥物包封率及體外釋放效率的測定

將載藥納米顆粒離心收集時(shí)的上清液作為試樣，通過高效液相色譜儀（HPLC）檢測游離順鉑的濃度，得到游離的順鉑藥物質(zhì)量，計(jì)算出順鉑藥物在納米顆粒中的包封率及載藥量[17].

包封率（%）=（順鉑投入總量-游離順鉑質(zhì)量）/ 順鉑投入總量 × 100%（1）

載藥量（%）=（順鉑投入總量-游離順鉑質(zhì)量）/ 收集的載藥納米顆粒質(zhì)量 × 100%（2）

順鉑藥物體外釋放實(shí)驗(yàn)：將4 mg載順鉑納米顆粒分散于8 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）后轉(zhuǎn)移到透析袋中，加入9倍體積PBS釋放介質(zhì)，在搖床中于37 ℃以100 r·min-1恒溫震蕩，于不同時(shí)刻取出2 mL釋放介質(zhì)作為樣品，并加入等量新鮮介質(zhì)，用HPLC檢樣品中順鉑濃度，并計(jì)算其累計(jì)釋放效率.色譜條件：流動(dòng)相：10%甲醇，90%水；流量體積：1 mL/min；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：20 μl；色譜柱型號：C-185 μm （250 mm×4.6 mm）.

1.2.4 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)是一種全面評價(jià)細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)方法[18-19]，具體實(shí)驗(yàn)操作如下：吸去細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，使用PBS清洗細(xì)胞，加入含有EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞后加入適量培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù).將含有500個(gè)細(xì)胞的懸液加入含有8 mL新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中（直徑8 cm），將其均勻分散后放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中.細(xì)胞貼壁4 h后，分別加入等量的空白及載藥PHBV/葡聚糖納米顆粒.于培養(yǎng)箱中處理24 h后，使用37 °C預(yù)熱的PBS將納米顆粒洗凈，然后加入新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng).每三天換一次液，并在顯微鏡下觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)30～50個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞集落時(shí)取出細(xì)胞房，使用PBS洗去殘留的培養(yǎng)液，加入-20 °C預(yù)冷的甲醇，處理2～3 min，固定細(xì)胞.棄去甲醇，加入1%的結(jié)晶紫溶液（甲醇∶蒸餾水體積比為1∶1），室溫染色20～30 min.染色完畢后使用蒸餾水清洗培養(yǎng)皿，洗去結(jié)晶紫溶液.被染成紫色的細(xì)胞集落清晰可見，肉眼觀察對集落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞生存率.

2 結(jié)果與討論

2.1 納米顆粒的化學(xué)成分分析

通過傅立葉紅外光譜法對PHBV、葡聚糖以及制備的納米顆粒進(jìn)行成分分析，結(jié)果如圖2所示，紅外圖譜2（a）中1 724 cm-1為PHBV典型的羰基（C=O）伸縮振動(dòng)峰，1 280 cm-1為C-O-C的伸縮振動(dòng)峰，2 983 cm-1，2 934 cm-1，2 890 cm-1分別為-CH3，-CH2，-CH的反對稱伸縮振動(dòng)峰.紅外圖譜2（b）中3 430 cm-1為葡聚糖典型的羥基（-OH）伸縮振動(dòng)峰.制備的納米顆粒中含有明顯的羰基及羥基伸縮振動(dòng)峰，表明其化學(xué)成分由PHBV和葡聚糖構(gòu)成，如圖2（c）所示.

2.2 納米顆粒的粒徑及形貌分析

粒徑作為藥物載體系統(tǒng)的重要參數(shù)，以PHBV/葡聚糖納米顆粒粒徑為考量標(biāo)準(zhǔn)，將PHBV濃度、丙酮用量、初乳/外水相體積比作為參變量，通過三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳納米顆粒粒徑的制備參數(shù)，由表1分析可知，PHBV/葡聚糖納米顆粒平均粒徑隨PHBV濃度增大而增大，隨丙酮用量增大而減小，隨初乳/外水相體積比增大而減小，且初乳/外水相體積比對顆粒粒徑影響最大，PHBV濃度次之，丙酮用量對于顆粒粒徑影響較小，由此確定最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：PHBV濃度為3 mg/mL，丙酮用量為4 mL，初乳/外水相體積比為1∶6.

最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)下制備出PHBV/葡聚糖納米顆粒粒徑為205.0±6.9 nm（如圖3（a）所示），粒徑分布均勻，Zeta電勢為-1.59±0.12 mV（如圖3（b）所示）.有研究表明帶正電荷的藥物載體系統(tǒng)在靜脈注射后易與帶負(fù)電荷的血清白蛋白形成聚合物而被吞噬細(xì)胞識別排異，而表面不帶電荷的藥物載體系統(tǒng)則能有效降低血漿蛋白的吸附并提高細(xì)胞的非特異性攝取效率[20].通過透射電鏡觀察納米顆粒粒徑及形貌，結(jié)果如圖3（c）（d）所示，納米顆粒形貌圓潤，呈現(xiàn)出兩親性納米顆粒明顯的殼核結(jié)構(gòu).粒徑均勻且粒徑大小與動(dòng)態(tài)光散射法測試結(jié)果一致，由于腫瘤組織內(nèi)皮細(xì)胞間隙約為8～400 nm，且藥物釋放效率與載體尺寸相關(guān)，故藥物載體的粒徑為200 nm左右時(shí)，既能滿足大多腫瘤模型的EPR效應(yīng)，又具有較長的緩釋周期[21].

2.3 納米顆粒對順鉑藥物的包載及其體外釋放

順鉑作為一種常用化療藥物，通過疏水作用使順鉑包封于PHBV/葡聚糖納米顆粒的疏水內(nèi)核，通過加入不同質(zhì)量的順鉑探討其對包封率及載藥量的影響，結(jié)果表明（如表2所示），隨著順鉑投入質(zhì)量的增加，載藥量隨之增大，但包封率會相對降低，粒徑略微增大，而Zeta電勢無明顯變化.當(dāng)順鉑與PHBV質(zhì)量比為30%時(shí)，載藥量可達(dá)19.3±2.9%，包封率為51.5±7.7%.同時(shí)考慮順鉑藥物的利用效率與納米顆粒的包載能力，選用順鉑投入質(zhì)量為PHBV質(zhì)量的30%條件下的載藥納米顆粒進(jìn)行后期研究.

體外藥物釋放效率如圖4所示，順鉑水溶液（游離順鉑）在pH=5.5或7.4時(shí)快速擴(kuò)散到整個(gè)介質(zhì)中，釋放周期小于12 h，而順鉑包封于PHBV/葡聚糖納米顆粒后，藥物初始階段的突釋現(xiàn)象顯著降低，且在正常組織環(huán)境pH=7.4時(shí)釋放緩慢，7 d累計(jì)釋放量約為60%，而在腫瘤組織環(huán)境pH=5.5時(shí)釋放較快，7 d累計(jì)釋放約80%.PHBV/葡聚糖納米藥物載體表現(xiàn)出的pH響應(yīng)性主要得益于PHBV/葡聚糖納米顆粒在酸性環(huán)境下比在中性環(huán)境下具有更快的溶脹速率，而使小分子藥物通過滲透作用得以釋放[22].綜上所述，PHBV/葡聚糖載藥納米顆粒在減少藥物初始階段突釋效應(yīng)而降低對正常細(xì)胞的毒副作用，并且通過延長藥物緩釋時(shí)間減少化療用藥次數(shù)、用藥劑量并提高化療藥物治療效率.且藥物載體具有一定的pH響應(yīng)性，在正常組織中釋放緩慢，而在腫瘤組織中具有較快的釋放效率，對于化學(xué)治療中降低對正常組織的殺傷作用，以及增強(qiáng)對腫瘤組織的治療效果具有重大意義.

2.4 納米顆粒的細(xì)胞毒性

細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)是一種全面評價(jià)細(xì)胞毒性的手段，為了驗(yàn)證PHBV/葡聚糖納米顆粒作為藥物載體的生物相容性及載藥納米顆粒的細(xì)胞毒性，采用人體宮頸癌細(xì)胞HeLa以及人體正常肝細(xì)胞L02作為細(xì)胞模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn).結(jié)果如圖5（a）所示，在空白納米顆粒濃度高達(dá)100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率仍達(dá)到80%以上，表明PHBV/葡聚糖納米顆粒對正常細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)良好的生物相容性.圖5（b）（c）顯示同等濃度下載藥納米顆粒對正常細(xì)胞的殺傷作用明顯小于腫瘤細(xì)胞，具有顯著性差異，表明該載藥納米顆粒對腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作用，作用機(jī)制與腫瘤細(xì)胞對葡萄糖的代謝更加旺盛有關(guān)，由于納米顆粒表面的葡聚糖水解產(chǎn)生大量葡萄糖，從而增加腫瘤細(xì)胞對納米顆粒的攝取，導(dǎo)致更高濃度的順鉑藥物作用，從而對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制效果[23].綜上所述，PHBV/葡聚糖納米顆粒作為一種新型納米制劑，具有良好的生物相容性及對腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的殺傷作用，有望在癌癥化療中發(fā)揮更好的治療效果.

3 結(jié) 論

兩親性聚合物納米藥物載體在提高化療藥物藥效的同時(shí)降低毒副作用，對于癌癥治療具有重要意義.通過雙乳液溶劑揮發(fā)法制備的新型PHBV/葡聚糖納米藥物載體，其粒徑均一，表面幾乎不帶電荷，呈明顯殼核結(jié)構(gòu)狀的球形顆粒.通過對疏水性化療藥物順鉑的包載，該載藥納米顆粒具有較高的包封率及載藥量，且體外緩釋效果顯著，對正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的pH環(huán)境具有明顯的響應(yīng)性，且該載藥納米顆粒對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用明顯高于正常細(xì)胞，在癌癥治療中能顯著降低化療藥物對正常組織的毒副作用.PHBV/葡聚糖納米顆粒有望成為一種新型抗腫瘤藥物載體，對更多的疏水性抗腫瘤藥物進(jìn)行有效包載并達(dá)到緩釋效果，甚至可實(shí)施親疏水性藥物間的聯(lián)合治療，以提高化療效率并減輕毒副作用.

參考文獻(xiàn)

[1] NICOLAS J， MURA S， BRAMBILLA D， et al. Design， functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery[J]. Cheminform， 2013，42（3）：1147-1235.

[2] FONSECA A， FERREIRA P， CORDEIRO R， et al. Drug delivery systems for predictive medicine： polymers as tools for advanced applications[C]//M. S. Mozaffari. New Strategies to Advance Pre/Diabetes Care： Integrative Approach by PPPM， Volume 3 of the Series Advances in Predictive， Preventive and Personalised Medicine， 2013：399-455.

[3] 黃飛云， 屠錫德. 難溶性抗腫瘤藥物注射劑的制劑研究[J]. 藥學(xué)進(jìn)展，2002，26（2）：71-76.

HUANG F Y， TU X D. Advances in injections of insoluble antitumor drugs[J]. Progress in Pharmaceutical Sciences， 2002，26（2）：71-76.（In Chinese）

[4] ALEXIS F， PRIDGEN E， MOLNAR L K， et al. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles[J]. Molecular Pharmaceutics， 2008，5（4）：505-515.

[5] DU Y， WENG Q， YUAN H， et al. Synthesis and antitumor activity of stearate-g-dextran micelles for intracellular doxorubicin delivery[J]. Acs Nano， 2010，4（11）：6894-6902.

[6] MATSUMURA Y M， MAEDA H A. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy： mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs[J]. Cancer Research， 1986，46：6387-6392.

[7] LI M， TANG Z， ZHANG Y， et al. LHRH-peptide conjugated dextran nanoparticles for targeted delivery of cisplatin to breast cancer[J]. Journal of Materials Chemistry B， 2014，2（22）：3490-3499.

[8] LIU Y， LI J， REN J， et al. Preparation and in vitro pH-responsive drug release of amphiphilic dendritic star-block copolymer complex micelles[J]. Materials Letters， 2014，127：8-11.

[9] NIGMATULLIN R， THOMAS P， LUKASIEWICZ B， et al. Polyhydroxyalkanoates， a family of natural polymers， and their applications in drug delivery[J]. Journal of Chemical Technology & Biotechnology， 2015，90（7）：1209-1221.

[10]VILOS C， MORALES F A， SOLAR P A， et al. Paclitaxel-PHBV nanoparticles and their toxicity to endometrial and primary ovarian cancer cells[J]. Biomaterials， 2013，34（16）：4098-4108.

[11]MASOOD F， CHEN P， YASIN T， et al. Encapsulation of Ellipticine in poly-（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate） based nanoparticles and its in vitro application[J]. Materials Science & Engineering C： Materials for Biological Applications， 2013，33（3）：1054-1060.

[12]ZOU P， LIU H， LI Y， et al. Surface dextran modified electrospun poly （3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate） （PHBV） fibrous scaffold promotes the proliferation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J]. Materials Letters， 2016，179：109-113.

[13]WANG N， ZHOU Z， XIA L， et al. Fabrication and characterization of bioactive β-Ca2SiO4/PHBV composite scaffolds.[J]. Materials Science & Engineering C： Materials for Biological Applications， 2013，33（4）：2294-2301.

[14]LIU P， SITU J Q， LI W S， et al. High tolerated paclitaxel nano-formulation delivered by poly （lactic-co-glycolic acid）- g -dextran micelles to efficient cancer therapy[J]. Nanomedicine Nanotechnology Biology & Medicine， 2015，11（4）：855-866.

[15]祝興勇， 張文萍， 尤啟冬， 等. 鉑（Ⅱ）類抗腫瘤藥物[J]. 化學(xué)進(jìn)展，2008，20：1324-1340.

ZHU X Y， ZHANG W P， YOU Q D， et al. Antitumor platinum（Ⅱ）drugs[J]. Progress in Chemistry， 2008，20：1324-1340.（In Chinese）

[16]ALAM N， KHARE V， DUBEY R， et al. Biodegradable polymeric system for cisplatin delivery： Development， in vitro characterization and investigation of toxicity profile[J]. Materials Science & Engineering C， 2014，38（38）：85-93.

[17]SAHANA B， SANTRA K， BASU S， et al. Development of biodegradable polymer based tamoxifen citrate loaded nanoparticles and effect of some manufacturing process parameters on them： a physicochemical and in-vitro evaluation[J]. International Journal of Nanomedicine， 2010，5：621-630.

[18]FRANKEN N A， RODERMOND H M， STAP J， et al. Clonogenic assay of cells in vitro[J]. Nature Protocols， 2006，1（5）：2315-2319.

[19]BLUNDEN B M， LU H， STENZEL M H. Enhanced delivery of the RAPTA-C macromolecular chemotherapeutic by conjugation to degradable polymeric micelles[J]. Biomacromolecules， 2013， 14（12）：4177-4188.

[20]LI J， YU X， WANG Y， et al. A reduction and pH dual-sensitive polymeric vector for long-circulating and tumor-targeted siRNA delivery[J]. Advanced Materials， 2014， 26（48）：8217-8224.

[21]CHOW E K， HO D. Cancer nanomedicine： from drug delivery to imaging[J]. Science Translational Medicine， 2013， 5：216-224.

[22]馬方奎. 基于殼聚糖PLGA納米載體的構(gòu)建及其水解釋藥研究[D]. 中國海洋大學(xué)， 2013：58-69.

MA F K. Chitosan-PLGA nanocarrier systems for hydrolytic erosion and drug release[D]. Ocean University of China， 2013：58-69.（In Chinese）

[23]霍希琴， 霍海玲， 伍旭， 等. 納米顆粒-葡萄糖與腫瘤細(xì)胞的相互作用[J]. 湖南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，36（3）：67-70.

HUO X Q， HUO H L， WU X， et al. The Interaction between Cancer Cells and Nanoparticles-glucose Bioconjugates （FSiNPs-DG）[J]. Journal of Hunan University（Natural Sciences）， 2009，36（3）：67-70.（In Chinese）