鹿茸多肽蛋白的提取及功能研究

高 冷，王昊天，牛曉暉，楊富雅，呂思丞，高曉晨

（1.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春 130012；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

鹿茸是雄鹿軟骨形態(tài)沒(méi)有形成堅(jiān)硬骨質(zhì)形態(tài)的嫩角，自古以來(lái)就是我國(guó)名貴的中藥?！侗静菥V目》中曾有記載，鹿茸能生精補(bǔ)髓， 養(yǎng)血益陽(yáng)， 強(qiáng)筋健骨，鹿茸中含有多種生物活性物質(zhì)， 能夠有助于受損機(jī)體的愈合調(diào)節(jié)作用，能促進(jìn)新陳代謝，預(yù)防和治療多種疾病[1]。但是鹿茸的化學(xué)和藥理學(xué)研究并不深入，無(wú)法確定鹿茸的準(zhǔn)確服用劑量和其能治療的病癥[2]。目前已知對(duì)生物細(xì)胞組織有效果的物質(zhì)為多肽和蛋白質(zhì)，而鹿茸中50%以上是蛋白類物質(zhì)[3]。然而傳統(tǒng)的熱提取方法對(duì)鹿茸蛋白破壞較大，嚴(yán)重影響了鹿茸的藥用功能，因此，尋找到一種更好的方法來(lái)提取，不但能提高鹿茸蛋白的藥性，還能節(jié)省原料[4]。本研究通過(guò)用不同的方法來(lái)提取鹿茸多肽蛋白并加以比較，確定較佳的提取工藝，并對(duì)提取的鹿茸蛋白進(jìn)行蛋白酶酶解處理，之后對(duì)鹿茸多肽蛋白的抗感染效果進(jìn)行研究[5]。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1原料 鹿茸樣品取自長(zhǎng)春雙陽(yáng)梅花鹿場(chǎng)4年生梅花鹿；堿性蛋白酶購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；中性蛋白酶購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；胃蛋白酶購(gòu)自中國(guó)盛世生物有限公司；NIH3T3細(xì)胞來(lái)自中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用研究所。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 冷凍干燥機(jī)購(gòu)自北京松原華興科技發(fā)展有限公司，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司，超聲提取機(jī)購(gòu)自 寧波新芝生物科技股份有限公司。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1超聲法提取鹿茸蛋白 分別稱取1 000 g、2 000 g、3 000 g新鮮鹿茸剝皮，用切片機(jī)切成1～2 cm厚的薄片。稱取一定量鮮鹿茸放入超聲儀器中，并加入50%的酒精水溶液直至沒(méi)過(guò)鹿茸5～10 cm，在20℃的溫度下超聲24 h。之后過(guò)濾，將濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，為保證不發(fā)生蛋白變性影響實(shí)驗(yàn)，溫度一般選在80℃以下。將濾液濃縮到1 L左右后取出，倒入托盤(pán)中，放入干燥箱80℃干燥直至水分完全蒸干，取出用粉碎機(jī)磨粉過(guò)80目篩，稱重并密封保存[6]。

2.2CO2超臨界萃取法提取鹿茸蛋白 新鮮鹿茸剝皮切片，稱重后放入- 40℃冰箱冷凍24 h。待其冷凍完全，放入冷凍干燥機(jī)干燥24 h，直至鹿茸切片發(fā)白，水分少于3%停止干燥。用粉碎機(jī)粉碎成粉，并過(guò)80目篩，放入CO2超臨界萃取裝置萃取桶中。在以壓力為20 mPa，溫度為20℃，流速為20的條件下萃取，得到鹿茸蛋白。

2.3細(xì)胞復(fù)蘇 把冷凍好的細(xì)胞從- 80℃的冰箱中迅速取出，將其放置在恒溫水浴鍋中，水溫為細(xì)胞適宜的37℃，等到凍存管內(nèi)的液體融化完全后，將其加入15 mL的離心管中，同時(shí)把4 mL細(xì)胞培養(yǎng)液緩緩加入離心管中，再將裝好細(xì)胞的離心管放入離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為1 000 r/min，離心5 min，把1 mL培養(yǎng)液用移液槍加入，并向其吹勻，將細(xì)胞放于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中加入9 mL培養(yǎng)液和1 mL血清。

2.4細(xì)胞傳代 等到培養(yǎng)皿的80%以上都鋪滿所培養(yǎng)的細(xì)胞后，棄掉培養(yǎng)皿中全部的培養(yǎng)基，向其中加入胰酶2 mL，在37℃的條件下，讓其消化2～5 min，降解細(xì)胞之間結(jié)合處蛋白，使之不再黏連貼壁，向其加入1 mL血清和3 mL培養(yǎng)基用移液槍吹起，將其加入到15 mL的離心管中，并放入離心機(jī)離心，將沉淀用3 mL培養(yǎng)液吹起，把它們分成3份，分別放入3個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

2.5細(xì)胞凍存 1 mL凍存體系為500 μL血清、400 μL培養(yǎng)液和100 μL DMSO。凍存液要在實(shí)驗(yàn)之前配置好，現(xiàn)用現(xiàn)配。把已經(jīng)不在黏連的細(xì)胞放置于凍存液當(dāng)中，之后放于- 20℃冰箱存儲(chǔ)冷凍2 h，然后將其轉(zhuǎn)到- 80℃冰箱中。

2.6MTT實(shí)驗(yàn) 1）接種細(xì)胞[7]，單個(gè)細(xì)胞懸液的配置，須由10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成，并將其接種到96孔板中，其中每孔中有1 000～10 000個(gè)細(xì)胞，每個(gè)孔的體積是200 μL。2）培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)，直到其黏連貼壁，在每個(gè)孔中加入各種鹿茸多肽蛋白，其質(zhì)量為5 mg，之后培養(yǎng)24 h。3）呈色，培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，每個(gè)孔中加MTT溶液（用5 mg/mL PBS配制，pH = 7.4）20 μL，連續(xù)培養(yǎng)4 h。之后停止培養(yǎng)，小心吸出孔內(nèi)的培養(yǎng)液上清液，并將其棄掉，若發(fā)現(xiàn)孔中有細(xì)胞懸浮，則需要將其以1 000 r/min離心5 min，之后再吸出孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔中加入150 μL DMSO，振蕩10 min，能充分融解孔內(nèi)的晶體物質(zhì)。4）比色，波長(zhǎng)的選擇為490 nm，測(cè)定各孔的吸光度，測(cè)試儀器為酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。把時(shí)間設(shè)為橫坐標(biāo)，縱坐標(biāo)為吸光值來(lái)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2.7NIH3T3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[8]1）將NIH3T3細(xì)胞分到96孔板中，每孔各加入105個(gè)NIH3T3細(xì)胞，之后在向每孔中加含10%胎牛血清的半DMEM培養(yǎng)液200 μL，之后放置在CO2培養(yǎng)箱中，以溫度設(shè)為37 ℃、CO2濃度設(shè)為5 %，在此條件下培養(yǎng)24 h。2）吸出上清液，并向每孔中加入包含濃度為0.5%胎牛血清的培養(yǎng)液200 μL，之后放置在CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為37 ℃、CO2濃度為5 %，在此條件下培養(yǎng)24 h。3）把終濃度為1 mmol/L的阿司匹林加入各孔中，之后放置在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃、CO2濃度為5%，在此條件下培養(yǎng)30 min。4）丟棄掉上清液，用PBS液（200 μL）沖洗每個(gè)孔，之后向每個(gè)孔中加入200 μL的10%血清半DMEM培養(yǎng)液，以溫度為其最適宜的37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)3 h。5）向每個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔中分別加入相同質(zhì)量的羅非昔布，陰性對(duì)照組不給藥,加藥孔分別加入不同質(zhì)量的鹿茸水解總蛋白、胃蛋白酶水解鹿茸蛋白、中性蛋白酶水解鹿茸蛋白和堿性蛋白酶水解鹿茸蛋白（0.5、1、2.5、5 mg），37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)30 min。6）分別向每個(gè)孔中加入終濃度為2 μmol/L的花生四烯酸溶液，以溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)15 min。7）與ELISA試劑盒操作相同。

2.8PGE2 分泌量檢測(cè) 1）樣品制備：吸取加鹿茸多肽蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液50 μL。2）加樣：各設(shè)置空白孔（空白對(duì)照孔不加入樣品和酶標(biāo)試劑）、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)孔。在標(biāo)準(zhǔn)品孔中精確加入50 μL的標(biāo)準(zhǔn)樣品，將50 μL待測(cè)樣品加入待測(cè)孔中。樣品需加入酶標(biāo)板的底部，盡量不觸及孔壁，輕輕搖晃，使其充分混合[9]。3）溫育：用 封板模封板后置于37 ℃溫育30 min。4）配液：將濃縮30倍的洗滌液用蒸餾水稀釋30倍后，放于一旁備用。5）洗滌：小心揭掉封板模，丟棄掉其中液體，甩干，向每個(gè)孔中加入洗滌液直至加滿，靜置30 s后棄去洗滌液，如此往返重復(fù)5次，拍干。6）加酶：向每個(gè)孔中加酶標(biāo)試劑各50 μL，空白孔不加。7）溫育：用封板模封板后置于37 ℃溫育30 min[3]。8）洗滌：小心揭掉封板模，丟棄掉其中液體，向每個(gè)孔中加入洗滌液直至加滿，靜置30 s后棄去洗滌液，如此往返重復(fù)5次，拍干。9）顯色：先將50 μL顯色劑A分別加入每一個(gè)孔中，然后向每孔中再加入50 μL顯色劑B，之后將兩者輕輕震蕩使其混合均勻，將其置于37 ℃條件下避光顯色15 min[2]。10）終止：將50 μL終止液分別加入每個(gè)孔中以終止反應(yīng) （此時(shí)溶液會(huì)由藍(lán)色變成黃色）。11）測(cè)定：以空白孔為零，波長(zhǎng)為450 nm，測(cè)量各孔的吸光度。測(cè)定須在各孔加終止液后15 min內(nèi)進(jìn)行。

3　結(jié)果

3.1鹿茸蛋白提取結(jié)果比較 見(jiàn)表1～2及圖1。

如表1及圖1所示，在其它條件相同的條件下，其中CO2超臨界萃取提取率要略高于用超聲法提取鹿茸蛋白，提取率高1.0%，所以較佳的提取方法是CO2超臨界萃取法提取鹿茸蛋白。

3.2鹿茸多肽蛋白抗感染效果 見(jiàn)表2。

表1　超聲法與CO2超臨界萃取法提取鹿茸蛋白提取率

圖1　超聲提取與CO2超臨界萃取提取率

如表2所示，用體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，檢測(cè)NIH3T3細(xì)胞生成的PGE2濃度來(lái)計(jì)算鹿茸多肽蛋白的抗感染效果，并將其與羅非昔布進(jìn)行對(duì)比。發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽蛋白在以NIH3T3 為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜁r(shí)，當(dāng)干粉給藥20 mg時(shí)，與陽(yáng)性藥物羅非昔布抗炎效果相當(dāng)，50 mg時(shí)鹿茸多肽蛋白的抗感染效果要高于羅非昔布。

表2　鹿茸多肽蛋白抗感染效果檢測(cè)（NIH3T3細(xì)胞）　pg/mL

表3　各酶解鹿茸多肽蛋白抗感染效果檢測(cè)（NIH3T3細(xì)胞）　　　　　　　pg/mL

如表3及圖2所示，NIH3T3體外實(shí)驗(yàn)表明，NIH3T3生成的PGE2濃度可以折算成其抗感染效果，計(jì)算并將其與羅非昔布進(jìn)行對(duì)比。各酶解鹿茸蛋白在給藥20 mg時(shí)，酶解鹿茸蛋白抗感染效果：酶解鹿茸總多肽蛋白>中蛋白酶酶解鹿茸多肽蛋白>胃性蛋白酶酶解鹿茸多肽蛋白>堿性蛋白酶酶解鹿茸多肽蛋白。在所有酶解鹿茸多肽蛋白中，酶解鹿茸總多肽蛋白抗感染效果要好于其他媒介鹿茸多肽蛋白。

圖2　酶解鹿茸蛋白提取物細(xì)胞抗感染效果檢測(cè)（NIH3T3細(xì)胞）

3　討論

在超聲波法取鹿茸多肽蛋白和CO2超臨界萃取法提取鹿茸蛋白的實(shí)驗(yàn)中較佳的提取方法是CO2超臨界萃取法，其較之超聲法提高率高，提取率有顯著差異。NIH3T3體外實(shí)驗(yàn)表明，檢測(cè)NIH3T3細(xì)胞生成的PGE2濃度來(lái)計(jì)算鹿茸多肽蛋白的抗感染效果，并將其與羅非昔布進(jìn)行對(duì)比。各酶解鹿茸蛋白在給藥5、10 mg時(shí)，酶解鹿茸總多肽蛋白的抗感染效果不明顯。但是各酶解鹿茸蛋白在給藥20 mg時(shí)，酶解鹿茸蛋白抗感染效果：酶解鹿茸總多肽蛋白＞中蛋白酶酶解鹿茸多肽蛋白＞胃性蛋白酶酶解鹿茸多肽蛋白＞堿性蛋白酶酶解鹿茸多肽蛋白，酶解鹿茸總多肽蛋白抗感染效果要好于其他媒介鹿茸多肽蛋白。