谷草青貯用耐低溫產(chǎn)乳酸芽孢桿菌的篩選、鑒定及性質(zhì)研究

趙蕊蕊，郭曉軍，張舒月，朱寶成

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071000）

谷草即收獲谷穗后的秸稈，是一種優(yōu)質(zhì)的牛馬等牲畜的飼料原料。我國谷子栽培面積及產(chǎn)量均居世界第一，谷草年產(chǎn)量約0.028億t（郭勇慶等，2009）。這些豐富的谷草秸稈不僅沒有得到有效的利用，反而被隨意棄置或者焚燒，處于一種高污染、高消耗、低產(chǎn)出的狀況，資源利用率不足70%（江平，2004）。谷草作為反芻動物利用的一種作物秸稈，由于其低含量的蛋白質(zhì)、高含量的木質(zhì)素與硅酸鹽和不平衡的礦物質(zhì)營養(yǎng)，單獨飼喂會導(dǎo)致反芻動物采食量和營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率降低（王旭等，2005）。因此，提高谷草秸稈飼喂的價值對于節(jié)約資源、保護環(huán)境和促進農(nóng)牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。

采用青貯技術(shù)處理后的谷草相比青貯前適口性更好，且可長期保存，同時寄生蟲危害的發(fā)生率有所降低。而青貯添加劑在飼料青貯中起著關(guān)鍵的作用。乳酸菌是微生物青貯劑中最早應(yīng)用的菌種。近年來，國內(nèi)外對于乳酸菌青貯添加劑做了大量的研究。侯美玲等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌劑的添加能有效地抑制蛋白質(zhì)水解酶以及酪酸菌的活性，降低氨態(tài)氮／總氮，從而有效保存青貯飼料中的營養(yǎng)價值。楊俊峰等（2011）研究表明，乳酸菌是青貯飼料中的主要菌群，其在飼料的發(fā)酵過程中起主要作用。但是乳酸菌是一類不形成芽孢的細菌，因此工業(yè)化生產(chǎn)不宜保存和運輸（吳逸飛等，2013）。從而導(dǎo)致乳酸菌劑應(yīng)用于生產(chǎn)的成本提高，造成不必要的損失。而芽孢桿菌具有極強的抗逆性，能耐熱、紫外線、多種溶劑、酸、堿等（楊立華等，2010），與乳酸菌相比較生產(chǎn)成本可以有效降低，在保存和運輸過程中減少損失。因此在工業(yè)生產(chǎn)中可以保證微生物菌劑的活性，提高其產(chǎn)品質(zhì)量（郭夏麗等，2012）。目前國內(nèi)對于芽孢桿菌作為青貯添加劑鮮有報道。

影響青貯效果的環(huán)境因素有很多，其中溫度是重要的影響因素之一。陳明霞等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，高溫條件下（45～55℃）接種商品乳酸菌不能提高青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，低溫條件下（5～15℃）乳酸菌發(fā)酵緩慢，需要較長時間抑制青貯有害微生物。青貯一般在秋冬季節(jié)進行，尤其谷草種植大多在北方或西部地區(qū)，收獲時溫度相對更低。在低溫條件下，微生物的代謝速率變慢，影響青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。因此篩選耐低溫的產(chǎn)乳酸芽孢桿菌已成為新的研究熱點（倪永清等，2013）。

本研究擬篩選出耐低溫且能產(chǎn)乳酸的芽孢菌株，應(yīng)用于谷草的青貯，以期提高谷草的青貯發(fā)酵品質(zhì)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品青貯谷草、全株谷草、串葉松香草等。

1.1.2培養(yǎng)基NA、LA培養(yǎng)基參照程麗娟等的方法配制（程麗娟等，2012），篩選培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基參照劉敏等（2008）的方法配制。

1.2方法

1.2.1初篩取10.0 g樣品置于100 mL無菌水中，于180 r/min、10℃搖床上震蕩30 min后進行梯度稀釋，取10-4～10-6的稀釋溶液各100 μL涂布于溴甲酚紫NA平板上，10℃培養(yǎng)24 h。篩選使溴甲酚紫NA平板變黃的菌株，劃線分離，4℃保存。

1.2.2復(fù)篩將初篩所得菌株活化后按6.0%的接種量接種于發(fā)酵液中，于10℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。取發(fā)酵液1 mL于離心管中，4℃、5000 r/min離心10 min，用溴甲酚紫平板擴散法復(fù)篩，選出產(chǎn)黃圈較快且直徑較大的菌株。

1.2.3氣相色譜分析將通過復(fù)篩的菌株進行氣相色譜分析，篩選乳酸產(chǎn)量較高的菌株。氣相色譜分析條件：檢測器溫度270℃，進樣器溫度270℃，柱溫初溫60℃，梯度升溫到220℃，進樣量為 2 μL，分流比 50：1，采樣時間 30 min。N2000 色譜工作站，采用保留時間定性，內(nèi)標法定量。

1.2.4菌株的鑒定參照楊繼業(yè)（2015）、王偉（2014）等的方法從形態(tài)學(xué)、16S rDNA序列分析和生理生化試驗對目的菌株進行種屬鑒定。

1.2.5菌株性質(zhì)研究

1.2.5.1生長曲線生長曲線的測定參照楊繼業(yè)等（2015）的方法。

1.2.5.2溫度耐受性試驗參照張舒月等（2018）的方法制備菌液，測定各組菌液600 nm下的吸光度。

1.2.5.3pH耐受性試驗參照張舒月等（2018）的方法制備菌液，測定各組菌液600 nm下的吸光度。

1.2.5.4抑霉菌試驗參照楊繼業(yè)等（2015）的方法。通過平板擴散法檢測目的菌株對禾谷鐮刀菌的抑菌活性。

1.2.5.5菌株產(chǎn)酸時間將活化的菌株以6.0%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，10℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，分別于 6、12、18、24 h取 1.5 mL發(fā)酵液于離心管中，4℃、5000 r/min離心10 min取上清液，加到溴甲酚紫NA平板孔中，觀察產(chǎn)黃圈情況。

2　結(jié)果

2.1初篩結(jié)果用溴甲酚紫NA平板初篩產(chǎn)酸的菌株，篩選出能在低溫條件下生長并使溴甲酚紫NA平板變黃的菌株共29株。

2.2復(fù)篩結(jié)果通過溴甲酚紫NA平板擴散法進行復(fù)篩，篩選出產(chǎn)圈時間快且直徑大的菌株11株。

2.3氣相色譜分析對復(fù)篩得到的菌株的發(fā)酵液進行氣象色譜分析。經(jīng)分析得到一株產(chǎn)乳酸較高的菌株F-1，乳酸含量達到1328.9 mg/L，乙酸含量達到435.1 mg/L。以此菌株作為目的菌株進行鑒定及性質(zhì)研究。

圖1　目的菌株產(chǎn)酸情況

2.4菌株鑒定

2.4.1形態(tài)學(xué)鑒定菌株F-1為革蘭氏陽性菌。菌落形態(tài)表面光滑，邊緣整齊，乳白色，不透明。菌體呈小桿狀，存在運動性，無莢膜，芽孢呈桿狀。2.4.2分子生物學(xué)鑒定將目的菌株的16S rDNA序列在NCBI網(wǎng)站進行同源性比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），菌株F-1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚在了一起。

圖2　菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4.3生理生化試驗結(jié)合菌株16S rDNA序列分析結(jié)果，參考模式菌株的生理生化試驗對菌株F-1進行生理生化鑒定試驗，結(jié)果見表1。綜合形態(tài)學(xué)、生理生化試驗、分子生物學(xué)鑒定得出F-1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

表1　菌株的生理生化試驗

2.5目的菌株的性質(zhì)研究

2.5.1生長曲線菌株F-1的生長曲線見圖3。0～6 h處于延緩期，6～10 h達到對數(shù)生長期，10～20 h到穩(wěn)定期，過了20 h菌株進入衰退期，菌株的生物量開始下降。

圖3　菌株生長曲線

2.5.2溫度耐受性見圖4。菌株F-1在不同溫度下均能生長，37℃時生長狀態(tài)最好，并且10℃的生物量與37℃的生物量沒有顯著差異，可見該菌株可以在低溫的條件下很好的生長。

圖4　菌株溫度耐受試驗

2.5.3pH耐受性見圖5。pH耐受試驗發(fā)現(xiàn)菌株F-1在不同 pH條件下均能生長，在pH為3.0時也有生長，說明F-1具有耐酸能力。

圖5　菌株pH值耐受試驗

2.5.4霉菌抑菌試驗

菌株F-1對禾谷鐮刀菌的抑菌試驗結(jié)果見圖6。由圖可見，F(xiàn)-1有明顯的抑菌圈，說明菌株對禾谷鐮刀菌有較強抑制作用。這樣就可以減少青貯之后禾谷鐮刀菌的生長，從而降低青貯后的霉菌毒素。

2.5.5產(chǎn)酸時間菌株F-1在6 h時產(chǎn)酸很少，而在12 h時產(chǎn)酸量明顯增大，并且隨著時間的延長產(chǎn)酸量越來越大（如圖7）。

圖6　菌株的抑菌試驗

圖7　目的菌株產(chǎn)酸時間試驗

3　討論

谷草質(zhì)地柔軟厚實、適口性好、營養(yǎng)價值高，是一種品質(zhì)良好的禾本科秸稈。李元迎等（2017）報道采用青貯技術(shù)處理谷草后可以更好地利用谷草，青貯后的谷草相比青貯前適口性更好，易于保存且可長期保存，同時可減少寄生蟲危害的發(fā)生。在整個青貯過程中乳酸是主要的有機酸。谷草中碳水化合物等營養(yǎng)成分含量豐富，在厭氧環(huán)境下，微生物能夠發(fā)酵谷草原料中的糖分，產(chǎn)生足夠的乳酸，使環(huán)境中的pH值迅速下降，從而達到有效抑制其他微生物的繁殖，保證獲得良好的青貯飼料品質(zhì)的目的。青貯過程中外界環(huán)境溫度也是影響谷草發(fā)酵品質(zhì)的一個重要因素。一般的菌株的最適生長溫度在30～40℃，溫度過高或者過低都會影響菌株的生長（陳明霞等，2016）。近年，許多研究者就青貯用耐高溫乳酸菌進行了篩選（Chen等，2013；Zhang等，2010；Weinberg等，2001、1998；Tamada等，1999），但對青貯用耐低溫乳酸菌的報道較少（秦麗萍等，2014；儲徐建等，2014；王翠等，2013；王鵬等，2011）。對能夠用于青貯的耐低溫產(chǎn)乳酸芽孢桿菌也鮮有報道。

從自然發(fā)酵的谷草中分離出29株能夠在低溫環(huán)境下生長的產(chǎn)酸菌，通過復(fù)篩得到一株產(chǎn)乳酸量較高的菌株F-1，乳酸含量達到1328.9 mg/L，最適生長溫度為10℃。通過形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA序列分析和生理生化試驗對目的菌株進行種屬鑒定，確定其為枯草芽孢桿菌，屬于規(guī)定的飼料用安全菌株。該菌株能高產(chǎn)乳酸，應(yīng)用于谷草的發(fā)酵能夠有效降低發(fā)酵過程中的pH，抑制有害微生物的生長，提高發(fā)酵品質(zhì)。菌株耐酸，在pH值為3.0時也能生長。芽孢菌容易運輸和保存，在生產(chǎn)實踐中有效降低生產(chǎn)成本。從氣相的測定結(jié)果可以看出F-1也產(chǎn)丙酸和乙酸，丙酸和乙酸對飼料的發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性均有影響。所以還可對其產(chǎn)乙酸，丙酸的情況做進一步的研究。目前市場上大部分的乳酸菌劑并沒有抑制真菌的功效，本試驗表明F-1對霉菌有顯著抑制作用，能夠有效改善谷草的發(fā)酵效果。菌株的產(chǎn)酸時間較快，且能在低溫環(huán)境下生長，在發(fā)酵過程中能夠更好更快的降低青貯飼料的pH值，達到理想效果。F-1有抗逆性，在不同環(huán)境下均能生長，下一步的工作是對菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，進一步研究菌株的應(yīng)用情況。

4　結(jié)論

本試驗獲得一株耐低溫產(chǎn)乳酸的枯草芽孢桿菌菌株，該菌株在pH 3.0，溫度10℃的條件下生長情況良好，能高產(chǎn)乳酸。