高效液相色譜法測定胡椒粉中胡椒堿的含量

朱映浩，劉波，黃為紅

（1.靖江市疾病預防控制中心，江蘇 靖江 214500；2.泰州市疾病預防控制中心，江蘇 泰州 225300）

胡椒粉是常見的日用調味品，具有去腥提味、解油 膩、助消化的功能，有黑胡椒粉和白胡椒粉兩種。胡椒粉中主要的活性物質是胡椒堿，胡椒堿在胡椒果實中的含量為1.7%～7.4%，胡椒堿易溶于乙醇、乙酸和二氯乙烷等，微溶于乙醚，不溶于水。目前，胡椒堿的測定方法主要有薄層紫外掃描法［1，2］、極譜法［3］、毛細管電泳 法［4］、紫外分 光光度 法［5，6］、高效 液 相 色 譜法［7－9］和 超 高 效 液 相 色 譜 法［10］等。GB/T 17528－1998［11］《胡椒堿含量的測定 分光光度法》利用胡椒堿在343nm波長處有最大吸收進行測定，操作簡單、快速，但由于其他類似生物堿以及一些在此波長下也有吸收的物質會對測定的結果造成正干擾，因此紫外分光光度法測定的胡椒堿含量通常會比高效液相色譜法偏高。目前，紫外分光光度法已被GB/T 17528－2009《胡椒堿含量的測定 高效液相色譜法》代替［12］，有必要對其方法進一步研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Waters e－2695高效液相色譜儀（配2998PDA 紫外檢測器） 美國沃特世公司；TU－1900雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；XDW－F100超低溫粉碎儀 濟南達微有限公司；BP－211D電子天平 北京賽多利斯儀器有限公司；Multi Relax旋渦混合器 德國海盜夫公司；SCQ數控定時超聲波清洗機 上海聲彥超聲波儀器有限公司；TG18G臺式離心機 湖南凱達科學儀器有限公司；AFX－2001－U優(yōu)柯浦純水機 上海渝欣實業(yè)發(fā)展有限公司。

胡椒堿標準品（98%）：北京百靈威科技有限公司；甲醇（HPLC色譜純）：德國 Merck公司；無水乙醇（HPLC色譜級）：CNW 公司；1，2－二氯乙烷（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；去離子水（18.28MΩ/cm）；胡椒粉：市售。

1.2 測定方法

1.2.1 高效液相色譜法

色譜柱：Waters Atlantis T3柱（250mm×4.6mm×5μm，沃特世公司）；流動相：甲醇∶水（75∶25）；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃；紫外檢測波長：343nm；進樣量：20μL。

1.2.2 紫外分光光度法

用1cm比色皿，在343nm波長下，將樣品待測液和標準曲線溶液分別測定吸光度，繪制校正曲線，由曲線計算出樣品濃度。

1.3 標準溶液的配制

胡椒堿標準儲備溶液1.0mg/mL：精密稱取25mg胡椒堿，于25mL棕色容量瓶中，加乙醇溶解，定容，得濃度為1.0mg/mL的標準儲備液，置于4℃冰箱備用。胡椒堿標準工作溶液10μg/mL，臨用現(xiàn)配，用微量移液器吸取250μL胡椒堿標準儲備溶液1.0mg/mL，于25mL棕色容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，得濃度為10μg/mL的標準工作溶液。

1.4 標準曲線的繪制

準確移取10μg/mL胡椒堿標準工作溶液0.5，1.0，3.0，5.0，7.0，10mL于10mL棕色容量瓶中，用乙醇稀釋配制成0.5，1.0，3.0，5.0，7.0，10μg/mL的胡椒堿標準系列。取1mL放入進樣瓶中，供液相色譜測定，保留時間和紫外光譜定性，外標法定量，余下溶液同時做紫外光譜測定。

1.5 樣品前處理

將市售胡椒粉或胡椒粒用超低溫粉碎儀磨碎，過孔徑為500μm（約30目）的不銹鋼篩，處理好的樣品存儲于棕色帶蓋螺口瓶中備用。稱取上述胡椒粉試樣0.2g（精確至0.0001g），于50mL帶蓋聚四氟乙烯離心管中（用黑塑料袋包裹），加入25mL乙醇，蓋塞，渦旋2min，超聲提取30min，3500r/min離心10min。準確移取提取液250μL，于25mL棕色比色管中，用乙醇定容至25mL，搖勻，此為待測液。用10mL注射器吸取待測液經0.45μm濾膜過濾，棄去初濾液0.5mL，取續(xù)濾液1.0mL于進樣瓶中供 HPLC測定，余下續(xù)濾液供紫外法測定。

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

試驗比較了 Waters Atlantis T3柱和 Waters Sunfire C18柱2種色譜柱，實驗發(fā)現(xiàn)：C18柱，胡椒堿保留時間4.124min，出峰較快；T3柱是改進后的超純硅膠基質C18柱，可以很好地保留胡椒堿，出峰時間12.032min，所以選擇 Waters Atlantis T3柱作為分離柱，色譜圖見圖1。

圖1 胡椒堿標準溶液液相色譜圖Fig.1Standard solution liquid chromatogram of piperine

2.2 檢測波長的選擇

對5.0μg/mL胡椒堿標準溶液在2998PDA紫外檢測器上進行全波長紫外掃描（掃描范圍190～400nm），發(fā)現(xiàn)胡椒堿在343nm波長處具有最大紫外吸收峰，因此，選擇343nm為檢測波長，見圖2。

圖2 胡椒堿標準溶液的紫外光譜圖Fig.2UV spectrogram of standard solution of piperine

2.3 樣品提取溶劑的選擇

根據胡椒堿的化學性質和相關文獻［13，14］，本實驗比較了二氯乙烷和乙醇溶劑，結果顯示：對于同一份樣品用二氯乙烷提取，測得胡椒堿含量3.27%，用乙醇提取，測得胡椒堿含量3.25%，兩者提取效率都在95%以上，考慮到二氯乙烷溶劑的毒性和乙醇實驗室的易得性，本實驗選擇乙醇作為提取溶劑。

2.4 提取方式的選擇

胡椒堿的提取主要有2種方式，加熱回流提?。?5］和超聲提?。?6］。本實驗對同一份樣品分別用乙醇進行回流提取和超聲提取。結果發(fā)現(xiàn)：回流提取，HPLC法測得胡椒堿的含量為4.23%；超聲30min提取，HPLC法測得胡椒堿的含量為4.57%。由于胡椒堿見光易分解，提取時要注意避光操作，回流法所用容器無法完全閉光，超聲提取只需用黑色塑料袋包裹離心管即可；另外，加熱回流提取一個樣品大約需要4h，耗時較長，而采用超聲提取大大縮短了提取時間，且易于批量化測定。因此，本文選用超聲提取。

2.5 線性范圍和檢出限

在本方法確定的實驗條件下，以濃度（C，μg/mL）為橫坐標，峰面積（A，AU）為縱坐標繪制標準工作曲線，見表1。以3倍噪聲（S/N＝3）計算檢出限，胡椒堿的最低檢出濃度均為0.1μg/mL，若按樣品取樣量0.2g，萃取液體積50mL計算，方法的檢出限均為25mg/kg。

表1 線性范圍和回歸方程Table 1Linear ranges and regression equations

2.6 回收率和精密度實驗

取已知含量的胡椒粉樣品3份，然后分別加入10μg/mL胡椒堿標準使用溶液0.5，1.0，2.0mL，HPLC法測定，每個添加水平重復測定6次，計算平均回收率，結果見表2。另取同一胡椒粉樣品6份，加入1.0mL 10μg/mL胡椒堿標準使用溶液，處理測定，計算RSD為2.53%。

表2 樣品加標回收率試驗結果（n＝6）Table 2Test results of the samples with spiked recoveries（n＝6）

2.7 樣品測定

采集市售胡椒粉18份，檢測結果見表3。比較發(fā)現(xiàn)：HPLC法與UV法的測定結果存在較大差異，造成結果差異的主要原因是UV法測定時一些在此波長下也有吸收的物質造成的正干擾，因此UV法測定的胡椒堿含量通常會比HPLC法偏高。

表3 市售胡椒粉樣品測定結果Table 3Determination results of pepper powder samples in the market

在實際工作中，當需要對樣品做出是否合格的判定時，根據 GB/T 7900－2008《白胡椒》［17］和 GB/T 7901－2008《黑胡椒》［18］的產品質量標準要求，胡椒堿的含量要求≥4.0%，若采用該標準原引用的UV法結果進行判定，18份樣品中有11份樣品合格；若采用現(xiàn)行有效的HPLC法對結果進行判定，5份樣品合格。追溯原因，筆者認為在于當初制定胡椒粉中胡椒堿含量限值≥4.0%，限于當時的紫外檢測設備，基于UV法制定的產品限量；目前，隨著HPLC儀器設備的普及，HPLC法替代了以前的UV法，產品檢驗方法更新，但相應的產品標準沒有配套更新，造成了對于同一份樣品用不同方法檢測，得出截然相反的判斷結果。本文測定結果與潘望等［19］的研究結果基本一致。

3 結論

本文建立了高效液相色譜法測定胡椒粉中胡椒堿含量的分析方法。樣品經低溫粉碎至30目，用乙醇超聲提取30min，離心后，0.45μm濾膜過濾。采用Waters Atlantis T3色譜柱分離，甲醇∶水（75∶25）作流動相，紫外檢測器波長343nm檢測，出峰時間適中，峰形良好，其他生物堿不干擾胡椒堿的測定，因而定量更準確。同時，本文比較了紫外分光光度法和高效液相色譜法測定胡椒堿含量的差異，在檢測結果運用時應注意。建議在胡椒粉中胡椒堿檢測方法更新的同時，其相應配套的產品質量標準應同步更新修訂。