堿法預(yù)處理麥糟酶解轉(zhuǎn)化還原糖工藝研究

連戰(zhàn)，呂志飛，劉彬，劉欣，莊倩倩，劉同軍

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，濟(jì)南 250353）

麥糟是啤酒生產(chǎn)中數(shù)量最多的副產(chǎn)物，大約占到了所有副產(chǎn)物的85%左右。而我國作為啤酒生產(chǎn)大國，每年麥糟的產(chǎn)量高達(dá)500萬噸［1，2］。傳統(tǒng)的對(duì)于麥糟的處理方式諸如堆肥，作為粗飼料等方式利用率較低，且極易造成環(huán)境污染，一種合理利用麥糟的方式亟待研究［3－5］。

相關(guān)研究表明，麥糟富含纖維素與半纖維素，可通過預(yù)處理及酶解轉(zhuǎn)化為葡萄糖與木糖等還原糖，經(jīng)分離純化后用于食品工業(yè)的生產(chǎn)，木糖可通過還原加氫生產(chǎn)木糖醇，且經(jīng)過酶解法產(chǎn)生的麥糟酶解液，木糖與葡萄糖純度較高，副產(chǎn)物較少，還原糖分離純化難度相應(yīng)得到降低［6－8］。與其他生物質(zhì)資源相比，經(jīng)過啤酒生產(chǎn)過程的麥糟，木質(zhì)素含量下降，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，對(duì)打破利用纖維素與半纖維素的生物質(zhì)壁障有一定的效果，但仍然存在一定難度。有效的預(yù)處理方法、合適的酶解工藝都需要進(jìn)一步的研究［9］。堿過氧化氫法能有效破壞木質(zhì)纖維素結(jié)晶區(qū)，使孔隙率和內(nèi)表面積增大，同時(shí)去除木質(zhì)素，從而有效破除酶解產(chǎn)生可發(fā)酵糖的生物質(zhì)壁障［10－12］。本文通過對(duì)低濃度與高濃度麥糟直接進(jìn)行酶解，探究AHP預(yù)處理對(duì)麥糟酶解效率的影響，同時(shí)因經(jīng)過啤酒釀造過程，麥糟成分與結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，AHP預(yù)處理的加堿量也需要重新進(jìn)行優(yōu)化。在堿過氧化氫法預(yù)處理的技術(shù)上進(jìn)一步對(duì)麥糟進(jìn)行水洗，去除酶活抑制物，以提高酶解轉(zhuǎn)化率，并在水洗的基礎(chǔ)上通過Mixture設(shè)計(jì)對(duì)多酶聯(lián)合酶解麥糟的加酶比例進(jìn)行優(yōu)化，為高效利用麥糟轉(zhuǎn)化還原糖提供一條有效的途徑。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料

麥糟：由齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）工程訓(xùn)練中心中德啤酒技術(shù)中心提供。

1.1.2 試劑

硫酸、5mol/L NaOH、H2O2：實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。

1.1.3 酶

纖維素酶（ctec2）、半纖維素酶（htec2）與果膠酶：均來自丹麥諾維信公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 成分分析

纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、還原糖及其他主要成分測定參照美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室（NREL）Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass測定方法進(jìn)行。

1.2.2 未預(yù)處理麥糟直接酶解

實(shí)驗(yàn)選擇10%，15%，20%的底物濃度進(jìn)行酶解。準(zhǔn)確稱取3.0g麥糟于50mL三角瓶中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)底物濃度加蒸餾水并混勻，使用72%H2SO4調(diào)節(jié)pH至5.2，分別添加ctec2與htec2，添加量為50mg總蛋白/g纖維素，添加比例為0.77∶0.23［13］，混勻后置于50℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中170r/min振搖24h，酶解結(jié)束后沸水浴滅活3～5min，取樣1mL于1.5mL離心管中，12000r/min下離心3～5min，取上清液測定葡萄糖及木糖濃度。

1.2.3 堿過氧化氫法預(yù)處理加堿量的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) NaOH 添加量為0.06，0.08，0.10g（NaOH/g麥糟），準(zhǔn)確稱取3.0g麥糟置于50mL三角瓶中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)量稱取NaOH于小燒杯中，加適量蒸餾水溶解，稱取H2O2溶液（H2O2/麥糟添加比例為0.1g/g），將混合均勻的NaOH溶液加入盛有小麥秸稈樣品三角瓶中，混勻后加入 H2O2溶液，置于30℃恒溫振蕩器中振搖，每隔2h測定并記錄pH。預(yù)處理結(jié)束，用72%H2SO4調(diào)節(jié)pH 至5.2，按照1.2.2步驟酶解并取樣測定糖濃度。

1.2.4 不同底物濃度下麥糟酶解

在上述實(shí)驗(yàn)條件下分別考察酶解底物濃度10%，15%，20%（W/V）下酶解效率的變化。預(yù)處理結(jié)束后，向預(yù)處理麥糟中添加72%H2SO4調(diào)節(jié)pH至5.2，按照1.2.2酶解步驟進(jìn)行酶解并取樣測定糖濃度。

1.2.5 酶解時(shí)間對(duì)糖得率的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)底物濃度為25%，稱取9.0g麥糟于300mL三角瓶中，在上述實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行預(yù)處理及酶解，并在酶解12，24，36，48，72h分別取樣測定糖濃度。

1.2.6 水洗對(duì)麥糟酶解糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取15.0g麥糟于300mL三角瓶中，按照

1.2.3進(jìn)行預(yù)處理，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)底物濃度為25%。預(yù)處理完畢后置于16層細(xì)密紗布上，1.5L蒸餾水多次沖洗至滴下液體無色。擠壓去除水分，準(zhǔn)確稱取0.50g擠壓后的底物，恒溫干燥箱105℃烘干4h后稱重并計(jì)算含水量，補(bǔ)水至原有底物濃度（25%），調(diào)節(jié)pH至5.2，按照1.2.2步驟進(jìn)行酶解，取樣測定糖濃度并計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

1.2.7 基于響應(yīng)面法三酶聯(lián)合酶解水洗麥糟的Mixture實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以水洗后AHP預(yù)處理的麥糟為底物，酶解葡萄糖轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)，使用 Design－Expert 8.0（DX8）軟件進(jìn)行Mixture實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化纖維素酶（ctec2）、半纖維素酶（htec2）與果膠酶的添加比例。預(yù)處理及酶解按照1.2.3與1.2.4步驟進(jìn)行。按照方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并通過軟件進(jìn)行分析，并對(duì)最佳加酶方案進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 測定與計(jì)算

葡萄糖及木糖的糖濃度通過高效液相色譜進(jìn)行測定，色譜柱為美國伯樂Aminex－87H色譜柱。檢測器為示差－折光檢測器，流動(dòng)相為0.005mol/L H2SO4，柱溫為65℃，流速為0.6mL/min。通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)糖濃度進(jìn)行計(jì)算。

纖維素→葡萄糖、半纖維素→木糖酶解轉(zhuǎn)化率分別按公式（1）與公式（2）計(jì)算。

式中：0.9為纖維素到葡萄糖的轉(zhuǎn)化系數(shù)；0.88為半纖維素到木糖的轉(zhuǎn)化系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 成分分析

采用NREL法進(jìn)行成分分析，結(jié)果見圖1。傳統(tǒng)的生物質(zhì)煉制原料多使用玉米、小麥等作物秸稈，與玉米秸稈30%～36%的纖維素含量，20%～26%的半纖維素含量、小麥秸稈31%～35%的纖維素含量，21%～25%的半纖維素含量相比［14－17］，麥糟纖維素及半纖維素含量相對(duì)較低，但經(jīng)過啤酒生產(chǎn)發(fā)酵的過程，木質(zhì)素含量明顯下降，酶解的生物質(zhì)壁障在一定程度上被破壞，意味著預(yù)處理難度的降低，選擇合理的預(yù)處理及酶解方式，會(huì)獲得相對(duì)理想的糖得率。

圖1 麥糟成分組成

2.2 堿過氧化氫法預(yù)處理加堿量的優(yōu)化

對(duì)堿過氧化氫法加堿量優(yōu)化pH監(jiān)測結(jié)果見圖2。不同加堿量下pH變化趨勢大致保持一致：在向麥糟中加入預(yù)處理液并攪拌均勻后，0.06，0.08，0.10g加堿量起始pH 分別為11.45，11.65，11.78，在1h后pH迅速上升，在4h左右達(dá)到峰值（0.06g加堿量下為1h），4h后pH逐步下降，pH的下降與預(yù)處理過程中NaOH與H2O2聯(lián)合作用被逐步消耗有關(guān)。三者在24h預(yù)處理后pH分別下降至11.18，11.94，12.38。

圖2 不同加堿量預(yù)處理pH變化

在不同加堿量下的酶解糖轉(zhuǎn)化率見圖3。在0.06g/g NaOH 添 加 量 下 轉(zhuǎn) 化 率 明 顯 低 于0.08，0.10g/g NaOH添加量，三者的葡萄糖轉(zhuǎn)化率分別為89.55%，93.17%，93.36%，NaOH 添加量從0.06g/g 增加到0.08g/g時(shí)，葡萄糖轉(zhuǎn)化率提升了3.62%，而繼續(xù)增加NaOH添加量至0.10g/g，葡萄糖轉(zhuǎn)化率僅提升0.19%，增幅很小。相關(guān)研究表明，在堿過氧化氫預(yù)處理中，增加堿及過氧化氫添加量能有效提高酶解轉(zhuǎn)化率，在pH 11.5附近進(jìn)行預(yù)處理能獲得較高的糖得率，但也有研究表明最適pH水平要高于11.7，同時(shí)不同的pH下過氧化氫的量也有所不同，這與木質(zhì)纖維素原料的特性以及反應(yīng)的底物濃度有關(guān)［18］，0.08g/g添加量下整體pH水平與這類研究接近。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明0.08g/g的堿添加量能獲得較高的糖轉(zhuǎn)化率，再增加NaOH添加量，對(duì)于轉(zhuǎn)化率提升效果較小，且會(huì)增加預(yù)處理成本。

圖3 不同加堿量預(yù)處理對(duì)酶解糖轉(zhuǎn)化率的影響

2.3 AHP預(yù)處理對(duì)麥糟酶解效果的影響

未經(jīng)預(yù)處理直接進(jìn)行酶解的麥糟糖得率見圖4。在10%底物濃度下，葡萄糖及木糖轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了54.4%，56.68%。隨著底物濃度的增加，糖濃度逐步升高，而轉(zhuǎn)化率迅速下降，到20%底物濃度，葡萄糖及木糖轉(zhuǎn)化率降低至44.7%，47.4%，而經(jīng)堿過氧化氫預(yù)處理的同底物濃度組轉(zhuǎn)化率則達(dá)到了74.5%，60.7%，分別提高29.8%，13.3%，轉(zhuǎn)化率大幅提高。李夏蘭等采用較低濃度酸堿預(yù)處理麥糟，在1∶40固液比（W/V）下獲得酶解糖轉(zhuǎn)化率為78.5%，且其反應(yīng)體系底物濃度較低［19］，明顯低于本實(shí)驗(yàn)中10%底物濃度（相當(dāng)于固液比1∶10）84.1%的纖維素酶解轉(zhuǎn)化率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明堿過氧化氫法能有效提高麥糟酶解轉(zhuǎn)化率，獲得的酶解液糖得率明顯提高。

圖4 AHP預(yù)處理對(duì)不同底物濃度酶解效率的影響

2.4 酶解時(shí)間對(duì)麥糟糖得率的影響

酶解時(shí)間對(duì)糖轉(zhuǎn)化率的影響見圖5。在0～12h，纖維素與半纖維素不斷轉(zhuǎn)化成葡萄糖以及木糖，隨著液化的進(jìn)行，轉(zhuǎn)化率迅速提高。12～24h，葡萄糖及木糖轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了69.4%，57.5%，之后迅速進(jìn)入平臺(tái)期。隨著糖及抑制物濃度的升高，轉(zhuǎn)化率增速明顯放緩，并在24～48h開始趨于穩(wěn)定。48～72h，轉(zhuǎn)化率變化較小，72h后轉(zhuǎn)化率水平基本穩(wěn)定。在24h，葡萄糖與木糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到穩(wěn)定的水平，葡萄糖與木糖濃度分別超過40，25g/L，還原糖產(chǎn)率及酶解效率較好，以24h作為酶解反應(yīng)周期較理想。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)糖轉(zhuǎn)化率的影響

2.5 水洗對(duì)麥糟酶解糖得率的影響

對(duì)25%底物濃度下AHP預(yù)處理麥糟進(jìn)行水洗后酶解轉(zhuǎn)化率見表1。

表1 水洗對(duì)高底物濃度麥糟轉(zhuǎn)化率的影響%

經(jīng)過水洗，葡萄糖與木糖轉(zhuǎn)化率均有明顯提升，分別提升了6.43%，3.87%。轉(zhuǎn)化率的提升與水洗去除了部分酶活抑制物（阿魏酸、對(duì)香豆酸等）以及水洗后明顯降低的液體粘度、明顯提高的傳質(zhì)效率有關(guān)。水洗在對(duì)抑制物去除的同時(shí)也帶來了固形物的損失，擠壓帶來的木質(zhì)纖維素角質(zhì)化等不良影響，減少了固形物損失，則轉(zhuǎn)化率將大幅提升。

2.6 纖維素酶、半纖維素酶與果膠酶復(fù)合酶解Mixture設(shè)計(jì)

以酶解葡萄糖轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)，利用Design－Expert 8.0（DX8）軟件進(jìn)行 Mixture實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)纖維素酶、半纖維素酶與果膠酶添加方案，其實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。

表2 Mixture設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 回歸模型的建立

運(yùn)用Design－Expert 8.0（DX8）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并進(jìn)行擬合得到的方程式為：Y（%）＝0.78A＋0.63B＋0.018C＋0.69AB＋1.65AC＋0.68BC＋0.10AB（A－B）－2.43AC（A－C）－0.96BC（B－C），該模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.9100，表明91.00%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)能符合這一模型的擬合。

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)

由表3可知，模型的F值為10.12，P值為0.0018，P≤0.01，說明該模型處于極顯著水平。同時(shí)，Adeq Precision信噪比為10.347，信噪比大于4是理想的［20］，表明該模型信號(hào)很強(qiáng)。綜上所述，該模型能很好地解釋響應(yīng)值的變化，得到的回歸方程模擬三因素三水平的設(shè)計(jì)分析是可行的。

2.8 影響酶解轉(zhuǎn)化率的響應(yīng)面分析

以酶解葡萄糖轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)指標(biāo)值，對(duì)纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面圖譜和等高線圖見圖6和圖7。

圖6 纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶之間的交互作用的立體分析圖

圖7 纖維素酶、半纖維素酶與果膠酶之間的交互作用的等高線圖

由圖6和圖7可知3個(gè)因素之間的交互作用對(duì)酶解轉(zhuǎn)化率的影響。等高線呈現(xiàn)的圓形與橢圓形表示不同因素之間的交互作用的強(qiáng)弱［21，22］。由圖6和圖7可知，纖維素酶和半纖維素酶以及半纖維素酶和果膠酶之間存在一定交互作用，纖維素酶和果膠酶之間的交互作用極為顯著。

2.9 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用 Design Expert 8.5Mixture設(shè)計(jì)給出的最優(yōu)加酶方案為ctec2∶htec2為0.63∶0.37，按照推薦的加酶比例，在上述預(yù)處理?xiàng)l件下進(jìn)行酶解驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并設(shè)置原加酶比例（0.77∶0.23）為對(duì)照組，3次平行實(shí)驗(yàn)得到的纖維素到葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為89.73%，與理論預(yù)測值88.96%相比高 0.77%，相對(duì)誤差為0.87%＜10%，且明顯高于對(duì)照組82.64%的葡萄糖轉(zhuǎn)化率，且半纖維素到木糖的轉(zhuǎn)化率也有明顯提升，相對(duì)提升7.5%。結(jié)果表明采用Mixture設(shè)計(jì)優(yōu)化的加酶方案準(zhǔn)確可行。

3 結(jié)論

利用堿過氧化氫法對(duì)麥糟進(jìn)行預(yù)處理能有效提高不同底物濃度下麥糟纖維素到葡萄糖以及半纖維素到木糖的轉(zhuǎn)化率。酶解時(shí)間24h，在較低底物濃度下（10%）酶解葡萄糖的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到80%以上，高底物濃度下（25%）轉(zhuǎn)化率可達(dá)70%。在堿過氧化氫預(yù)處理基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)麥糟進(jìn)行水洗，能有效提高糖酶解轉(zhuǎn)化率。

本實(shí)驗(yàn)確定了堿法預(yù)處理麥糟酶解轉(zhuǎn)化還原糖的工藝：預(yù)處理NaOH添加量0.08g/g底物，底物濃度25%，預(yù)處理后水洗，酶解時(shí)間24h，加酶比例ctec2∶htec2為0.63∶0.37。在該工藝條件下，纖維素到葡萄糖的轉(zhuǎn)化率與半纖維素到木糖的轉(zhuǎn)化率可分別達(dá)到89.73%，65.75%，較未預(yù)處理及優(yōu)化前分別提升約45%，18%。在該工藝下對(duì)麥糟進(jìn)行堿過氧化氫法預(yù)處理、水洗、酶解，能實(shí)現(xiàn)葡萄糖與木糖的高效轉(zhuǎn)化，這為啤酒工業(yè)合理利用麥糟提供了一條有效的途徑，也為利用生物質(zhì)資源綠色生產(chǎn)葡萄糖與木糖等還原糖提供了一種合理的方式。