RASA1與Ras-MAPK信號(hào)通路在URSA滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義

張丹瑜，張竣，肖云敏，錢衛(wèi)平

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東　汕頭　515041；2.深圳市人民醫(yī)院計(jì)劃生育科，廣東　深圳　518000；3.深圳市人民醫(yī)院龍華分院，廣東　深圳　518000；4.北京大學(xué)深圳醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，廣東　深圳　518000）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是婦產(chǎn)科和生殖科常見疾病，是指連續(xù)發(fā)生兩次或兩次以上的自然流產(chǎn)者，病因復(fù)雜而多，能識(shí)別病因的僅占50%，還有半數(shù)屬于不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。對(duì)于URSA患者的診斷和治療，臨床上存在較大的爭(zhēng)議，給臨床醫(yī)師及患者帶來很大的困擾。因此，分析URSA的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制，為研究URSA的發(fā)病及臨床診治提供新的思路和依據(jù)，具有重大的意義。

Ras蛋白是ras基因表達(dá)產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖中具有重要影響。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路位于 Ras下游，包括ERK、p38、JNK/SAPK等多個(gè)亞家族，其調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡，與人類惡性腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Ras-Raf-MEK-ERK途徑是Ras-MAPK信號(hào)通路中最經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，目前研究最為廣泛。近期的研究證實(shí)，Ras-MAPK通路可以調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，滋養(yǎng)細(xì)胞Ras-MAPK通路的異常可能導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[1]。Ras p21蛋白活化子 1（Ras p21 protein activator 1，RASA1）屬于 RasGTPase激活蛋白（GTPaseactivatingprotein，GAP）家族中的一員，具有讓Ras蛋白失活從而抑制Ras信號(hào)通路的功能?，F(xiàn)有研究表明，多種腫瘤的發(fā)生，與RASA1表達(dá)水平變化密切相關(guān)。但其在URSA的發(fā)生、發(fā)展中的作用研究鮮有報(bào)道。RASA1作為Ras-MAPK通路的直接調(diào)控蛋白，在滋養(yǎng)細(xì)胞中是否對(duì)Ras-MAPK通路具有調(diào)控作用，進(jìn)而影響妊娠結(jié)局，現(xiàn)在仍是未知。為了研究RASA1在URSA發(fā)生、發(fā)展過程中的作用,我們采用RT-qPCR研究URSA與健康正常妊娠女性絨毛組織的滋養(yǎng)細(xì)胞中RASA1與Ras-MAPK信號(hào)通路的mRNA表達(dá)水平的差異，并觀察其表達(dá)水平與臨床的相關(guān)聯(lián)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料實(shí)驗(yàn)組：選取2017年8月～2018年2月在本院計(jì)劃生育科就診、孕齡49～63 d、B超檢查未發(fā)現(xiàn)原始心管搏動(dòng)、臨床確診稽留流產(chǎn)、行負(fù)壓吸引術(shù)終止妊娠的URSA患者20例。對(duì)照組：同期同年齡段孕齡49～63 d、既往無任何不良孕產(chǎn)史且至少有一次或以上正常分娩史、本次妊娠無陰道流血等先兆流產(chǎn)癥狀、彩超檢查胚胎發(fā)育正常（有胚芽和心管搏動(dòng)且大小符合孕周）、要求行負(fù)壓吸引術(shù)終止妊娠的健康正常妊娠女性20例。

篩選標(biāo)本標(biāo)準(zhǔn)：研究對(duì)象需排除內(nèi)分泌、外科及內(nèi)科系統(tǒng)疾??；無血栓前狀態(tài)；無女性生殖系統(tǒng)畸形及炎癥；夫妻雙方染色體及胚胎染色體無異常；無自身抗體如抗磷脂抗體、抗核抗體、抗DNA抗體、抗精子抗體、抗甲狀腺抗體等；男方精液正常；孕期無劇烈運(yùn)動(dòng)、無服用含咖啡因類食品及嗜酒等不良生活習(xí)慣及嗜好等。

1.2RT-qPCR法采用RT-qPCR法分別測(cè)定URSA與健康正常妊娠女性絨毛組織的滋養(yǎng)細(xì)胞中的RASA1與Ras、ERK的mRNA含量。按試劑盒說明書進(jìn)行操作，以管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，RT-qPCR結(jié)果通過2-△△Ct法計(jì)算兩組目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，引物序列見表1。

表1　RT-qPCR實(shí)驗(yàn)所用引物序列Table 1　Primer sequences used in RT-qPCR experiment

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用t檢驗(yàn)比較兩組間的均數(shù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

在URSA患者滋養(yǎng)細(xì)胞中RASA1的mRNA含量高于健康正常妊娠女性滋養(yǎng)細(xì)胞中RASA1的mRNA含量。在URSA患者滋養(yǎng)細(xì)胞中RAS的mRNA含量低于健康正常妊娠女性滋養(yǎng)細(xì)胞中RAS的mRNA含量。在URSA患者滋養(yǎng)細(xì)胞中ERK的mRNA含量低于健康正常妊娠女性滋養(yǎng)細(xì)胞中ERK的mRNA含量，見表2。

表2　URSA患者和健康正常妊娠女性滋養(yǎng)細(xì)胞中RASA1、RAS、ERK的mRNA表達(dá)水平（x±s）Table 2　mRNAexpression levels of RASA1,RAS and ERK in trophoblast cell of URSApatients and normal pregnant women(x±s)

3　討論

ras基因是一類原癌基因，在生物進(jìn)化過程中高度保守，其表達(dá)的蛋白是Ras蛋白。Ras蛋白位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)，能與鳥苷酸結(jié)合，是膜結(jié)合型的GTP/GDP結(jié)合蛋白。與GDP結(jié)合時(shí)處于非活化狀態(tài)；反之，與GTP結(jié)合時(shí)為活化狀態(tài)，因此Ras的作用可視為分子開關(guān)。MAPK屬于細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以將細(xì)胞外刺激向細(xì)胞及細(xì)胞核內(nèi)傳導(dǎo)。MAPK包括ERK、p38、JNK/SAPK等多個(gè)亞家族，在Ras-MAPK信號(hào)通路中Ras-Raf-MEK-ERK通路目前研究得最為廣泛。該通路調(diào)控著許多生理活動(dòng)，如細(xì)胞增殖分化及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等，與腫瘤細(xì)胞分化關(guān)系密切。近期的研究證實(shí)，Ras-MAPK通路可以調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)功能，與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)。Zhu等[2]證實(shí)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的滋養(yǎng)細(xì)胞中Ras-MAPK通路處于失活狀態(tài)，進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，激活Ras-MAPK通路可以顯著促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖。Liu等學(xué)者發(fā)現(xiàn)[3]，Ras-MAPK通路可以促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的S期，從而促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖。細(xì)胞中有兩類信號(hào)蛋白調(diào)節(jié)Ras活性，它們分別是Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子（Rasguaninenucleotide exchange factors，Ras GEFs），在Ras GEFs作用下，GDP結(jié)合型轉(zhuǎn)化為GTP結(jié)合型；另一個(gè)是Ras GTP酶活化蛋白（Ras GAPs），其促使GTP向GDP的轉(zhuǎn)化。RASA1位于染色體5q13.1-14.3，在多種生長(zhǎng)因子的作用下，可調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡[4]。RASA1屬胞漿蛋白，相對(duì)分子量為120 kD，其C端是GTP酶活化蛋白（GAP）結(jié)構(gòu)域，具有催化作用，N端由PH、CaLB/C2、SH2、SH3等區(qū)域組成。RASA1可激活Ras GTP酶，能水解Ras GTP成Ras GDP而抑制Ras信號(hào)通路［5］。現(xiàn)有的研究表明：RASA1可以通過抑制Ras-MAPK通路進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［6-7］。

有關(guān)RASA1在URSA中的研究尚淺，本研究通過檢測(cè)URSA患者和健康正常妊娠女性絨毛組織滋養(yǎng)細(xì)胞中RASA1的mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，RASA1在URSA患者滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)率顯著高于健康正常妊娠女性滋養(yǎng)細(xì)胞中（P＜0.05）；此外，本研究結(jié)果顯示，RAS、ERK在URSA患者滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)率顯著低于健康正常妊娠女性（P＜0.05），說明在URSA患者滋養(yǎng)細(xì)胞中，RASA1的mRNA升高，可能會(huì)導(dǎo)致Ras-MAPK通路的失活，進(jìn)而讓絨毛組織的滋養(yǎng)細(xì)胞增殖能力下降，凋亡增加，侵襲種植能力減弱，最終導(dǎo)致流產(chǎn)。

綜上所述，滋養(yǎng)細(xì)胞Ras-MAPK通路的失衡在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中起重要作用，而RASA1與Ras-MAPK通路關(guān)閉失活密切相關(guān)。但是Ras-MAPK通路是如何發(fā)生異常的，其中的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。本研究證實(shí)RASA1在URSA滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)與健康正常妊娠女性有顯著差異。但本研究?jī)H采用RT-qPCR法檢測(cè)了RASA1 mRNA的表達(dá)情況，還有很大的不足。將來有關(guān)RASA1及Ras-MAPK信號(hào)通路在URSA的進(jìn)一步研究，有望為URSA的臨床診治提供新的方向。