PD-1/PD-L1的表達(dá)與鼻咽癌患者臨床分期及預(yù)后相關(guān)性研究

李鷹飛，邱華平，龍劍，查國華，饒曉軍，周慧霞

(江西省撫州市第一人民醫(yī)院，撫州 344000)

鼻咽癌是我國南方常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病與EB病毒感染、化學(xué)致癌因素、環(huán)境因素、遺傳因素有關(guān)，具有腫瘤細(xì)胞分化較差和對放化療敏感等特點[1]。目前主要治療方法包括：單純放療、同期放化療+輔助化療、同期放化療和誘導(dǎo)化療+放化療綜合治療。盡管大部分鼻咽癌病人能夠得到治愈，但也有一部分病人治療失敗出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

PD-1（程序性死亡受體-1）主要表達(dá)在活化T淋巴細(xì)胞膜上。PD-L1（程序性死亡配體-1）主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞膜上，在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上亦有表達(dá)，是PD-1的配體。PD-1和PDL1的結(jié)合能抑制T細(xì)胞的活化及增殖，出現(xiàn)腫瘤免疫抑制和免疫逃逸，最終可能導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。大量的報道表明，多種腫瘤組織中PD-1/PD-L1的表達(dá)與腫瘤患者分期和預(yù)后相關(guān)[2]。

本研究是通過免疫組化方法檢測鼻咽癌病理蠟塊組織中PD-1和PD-L1的表達(dá)，探討兩者與鼻咽癌患者臨床分期及預(yù)后關(guān)系。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來源 共收集58例從2010年5月-2015年7月在江西省撫州市第一人民醫(yī)院通過電子鼻咽鏡活檢、福爾馬林固定、石蠟包埋組織病理檢查診斷為非角化型鼻咽癌的蠟塊標(biāo)本，將放化療后電子鼻咽鏡活檢的鼻咽癌組織、鼻咽癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或其它部位轉(zhuǎn)移灶組織標(biāo)本排除在外。所有標(biāo)本對應(yīng)的鼻咽癌患者經(jīng)過常規(guī)放化療后均達(dá)到完全緩解。隨訪截至2017年6月份。

1.2免疫組化實驗步驟 ⑴鼻咽癌組織蠟塊4um厚切片；⑵二甲苯脫蠟，梯度酒精水化；⑶3%H2O2室溫孵育10min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；⑷蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min×2次；⑸微波加熱修復(fù)10min；⑹5%正常山羊血清封閉，室溫孵育10min，傾去血清，勿洗，滴加一抗工作液，37℃孵育1h；⑺PBS沖洗，5min×3次；⑻滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育 30min；⑼PBS沖洗，5min×3次；⑽滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（SABC）工作液，37℃孵育30min；⑾PBS沖洗，5min×3次；⑿DAB 室溫顯色 3min；⒀自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn) 在光鏡下(×400)10個視野計數(shù)，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比和陽性細(xì)胞染色強度兩個方面進行分析：⑴陽性細(xì)胞所占百分比（A）：無陽性細(xì)胞0分，陽性細(xì)胞百分比≤25%1分，陽性細(xì)胞百分比26%-50%2分，陽性細(xì)胞百分比51%-75%3分，陽性細(xì)胞百分比≥76%4分；⑵染色強度 (B)：無染色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩種記分相乘結(jié)果≥1表示陽性表達(dá)。

1.4研究標(biāo)本對應(yīng)的患者臨床分期及預(yù)后 臨床分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）鼻咽癌TNM分期系統(tǒng)（2010年第七版）。通過電話、復(fù)查方式進行隨訪，得到患者無疾病生存期（DFS）：從確診鼻咽癌開始至腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或最后一次隨訪的時間。隨訪截止時間為2017年6月。

1.5統(tǒng)計方法 采用SPSS 17.00軟件進行統(tǒng)計分析，使用χ2檢驗評價鼻咽癌組織中PD-1/PD-L1的表達(dá)與分期的關(guān)系。使用Kaplan-Meier方法對鼻咽癌患者無疾病生存期進行生存分析。P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2　結(jié)果

2.1鼻咽癌組織中PD-1/PD-L1表達(dá)情況 經(jīng)過免疫組化方法檢測，58例鼻咽癌組織中PD-1的表達(dá)陽性率為31.0%（18/58），PD-L1的表達(dá)陽性率為 53.4%（31/58）。

2.2鼻咽癌組織中PD-1/PD-L1表達(dá)與臨床分期的關(guān)系 58例鼻咽癌患者使用鼻咽癌AJCC TNM分期 （2010年第七版），與鼻咽癌組織中PD-1/PD-L1表達(dá)進行χ2檢驗評價，PD-1表達(dá)與臨床分期無明顯相關(guān)（P＞0.05），PD-L1陽性表達(dá)較陰性表達(dá) TNM 分期更晚（0.05＞P＞0.01）。

表1　鼻咽癌組織中PD-1/PD-L1表達(dá)與臨床分期的關(guān)系

2.3鼻咽癌組織中PD-1/PD-L1表達(dá)與患者無疾病生存期的關(guān)系 隨訪58例鼻咽癌患者，其中16例出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。在16例復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者中，有5例標(biāo)本PD-1表達(dá)陽性，13例PD-L1表達(dá)陽性。通過Kaplan-Meier方法進行生存分析，PD-1陽性表達(dá)與陰性表達(dá)無疾病生存期無差異（P=0.825）；PD-L1陽性表達(dá)較PD-L1陰性患者無疾病生存期明顯縮短（P=0.009）。

3　討論

本研究的最終結(jié)論為：經(jīng)常規(guī)放化療后達(dá)到完全緩解的鼻咽癌患者，PD-L1表達(dá)與臨床分期和無疾病生存期（DFS）有關(guān)，PD-1表達(dá)無明顯相關(guān)性。但在國內(nèi)外有關(guān)鼻咽癌組織中PD-1/PD-L1的表達(dá)和臨床分期及預(yù)后相關(guān)性的多項研究中，結(jié)果并不完全一致。張峰等[3]報道，PD-L1在正常鼻咽組織中無表達(dá)，在鼻咽癌組織中表達(dá)陽性率為67.8%（40/59），PD-L1陽性表達(dá)與鼻咽癌患者的年齡、性別無明顯相關(guān)，與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Hsu等[4]使用免疫熒光染色方法分析PD-1在正常鼻咽組織和鼻咽癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PD-1在鼻咽癌組織中CD8+T淋巴細(xì)胞上的表達(dá)明顯高于正常鼻咽組織（P＜0.0001），但與臨床分期無相關(guān)性，PD-1高表達(dá)鼻咽癌患者預(yù)后較差，無疾病生存期及總生存期縮短，局部復(fù)發(fā)增加（P值分別為 0.05、0.007 和 0.004）。 Zhang 等[5]報道，鼻咽癌組織中PD-1的表達(dá)陽性率為37.4%，PD-L1的表達(dá)陽性率為95%，PD-1/PD-L1的表達(dá)與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期無相關(guān)性，PD-1的表達(dá)對預(yù)后的影響不明顯（P=0.57），PD-L1高表達(dá)無疾病生存期明顯縮短，預(yù)后不良 （P=0.009），PD-1/PD-L1同時表達(dá)預(yù)后最差。本研究結(jié)果顯示，鼻咽癌組織中PD-L1陽性表達(dá)患者分期更晚，無疾病生存期明顯縮短，預(yù)后不良，阻斷PD-1/PD-L1通路的腫瘤免疫治療可能有效。但我們的研究為回顧性分析，樣本量較小，部分患者隨訪時間較短，需要進一步研究，為鼻咽癌針對PD-1/PD-L1通路的腫瘤免疫治療療效預(yù)測更好地提供理論依據(jù)。