高效液相色譜法測定頭痛寧膠囊中天麻素的含量

苑　博　馬海英　王　穎

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧　沈陽　110032）

頭痛寧膠囊由天麻、土茯苓、制何首烏、當(dāng)歸、防風(fēng)和全蝎六味中藥制成，具有熄風(fēng)滌痰、逐瘀止痛的功效，用于治療偏頭痛、緊張性頭痛屬痰瘀阻絡(luò)證，臨床效果顯著[1-2]。制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品標(biāo)準(zhǔn) （WS-11211(ZD-1211)-2002-2012Z）。標(biāo)準(zhǔn)中除常規(guī)檢查和理化鑒別外，對(duì)制劑中的大黃素（來源于制何首烏）含量設(shè)定了質(zhì)控限值[3]。制劑中天麻是方中主藥，味甘性平，歸肝經(jīng)，具有息風(fēng)止痙，平抑肝陽，祛風(fēng)通絡(luò)的功效，主要成分為天麻素[4-6]。為有效控制頭痛寧膠囊質(zhì)量，建議標(biāo)準(zhǔn)中增加對(duì)主藥天麻的含量限值控制。參考相關(guān)文獻(xiàn)方法[7-9]，本文建立了HPLC法測定頭痛寧膠囊中的天麻素含量，方法簡便快速、準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)，可用于頭痛寧膠囊中的天麻素的測定，為提高頭痛寧膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；電子分析天平（AL204型，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；超聲波清洗器（KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；天麻素標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110807）；乙腈（色譜純，美國Merck公司）；頭痛寧膠囊（陜西步長制藥有限公司，批號(hào)為170456、170522、170622、170729、170807）。其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈－0.1%冰醋酸 （2∶98 （v/v））；流速1.0 mL·min-1；柱溫40℃；檢測波長220 nm；樣量20 μL。2.2對(duì)照品溶液的配制 精密稱取天麻素對(duì)照品13.10 mg，置于10 mL容量瓶中用流動(dòng)相溶解定容，制成濃度為1.31 mg/mL的天麻素對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取適量天麻素對(duì)照品儲(chǔ)備液用流動(dòng)相稀釋成濃度為1.31、6.55、13.10、26.20、52.40和104.80 mg/L的天麻素對(duì)照品溶液。

圖1　空白溶液

2.3供試品試液的制備 取頭痛寧膠囊內(nèi)容物，混勻研細(xì)，精密稱取0.5 g置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇20 mL混勻，超聲波提取15 min，超聲波提取溫度為40℃，冷卻定容，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4陰性試液的制備 取頭痛寧膠囊處方中除天麻外的其他中藥材，按照制劑標(biāo)準(zhǔn)[3]比例和工藝制成不含天麻的陰性對(duì)照制劑，依據(jù)供試品溶液項(xiàng)下方法制備，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液作為陰性對(duì)照溶液。

2.5專屬性試驗(yàn) 分別將空白溶劑、天麻素對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液按色譜條件分析，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，供試品溶液和對(duì)照品溶液在保留時(shí)間約6.1 min處檢出天麻素色譜峰，而陰性對(duì)照溶液在此保留時(shí)間沒有色譜峰，表明在本色譜條件下，頭痛寧膠囊中的其他成分對(duì)天麻素的測定無干擾，理論塔板數(shù)按天麻素計(jì)＞2000，頭痛寧膠囊中天麻素的高效液相色譜圖見圖1（3），天麻素色譜峰與相鄰峰間分離度大于1.5。

2.6線性關(guān)系考察 分別吸取濃度為1.31、6.55、13.10、26.20、52.40和104.80 mg/L的天麻素對(duì)照品溶液按照2.1項(xiàng)下色譜條件分析，測定天麻素色譜峰面積，以峰面積A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C（mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=27.9454C+5.9771，相關(guān)系數(shù)為0.9998，天麻素在1.31~104.80 mg/L線性關(guān)系良好。

2.7檢測限和定量限 將天麻素對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分析，以3倍噪音時(shí)的天麻素濃度為方法檢測限，以10倍噪音時(shí)的天麻素濃度為方法定量限，結(jié)果天麻素的檢測限和定量限分別為0.03 mg/L和0.10 mg/L。

2.8精密度試驗(yàn) 取13.1 mg/L的天麻素對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分析，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算精密度，結(jié)果天麻素色譜峰面積的RSD%為0.55%，精密度良好。

2.9重復(fù)性試驗(yàn) 取頭痛寧膠囊樣品（批號(hào)170807） 按照2.3項(xiàng)下供試液制備方法制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分析，測定峰面積，計(jì)算天麻素含量。結(jié)果天麻素的平均含量為（0.48±0.01） mg，RSD為3.06%（n=6），方法的重復(fù)性良好。

2.10穩(wěn)定性試驗(yàn) 將制備好的頭痛寧膠囊樣品（批號(hào)170807） 供試液，分別在0、1、2、4、8、12和24 h進(jìn)樣，記錄天麻素色譜峰峰面積。結(jié)果峰面積RSD為1.79%，表明供試液均在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.11回收率試驗(yàn)精密稱取頭痛寧膠囊（批號(hào)170807）各約0.5 g，分別加入天麻素對(duì)照品溶液（濃度為1.31 mg/mL） 25 μL、100 μL和250 μL，制成含高中低3個(gè)濃度的樣品，每個(gè)濃度制備3份樣品，按照2.3項(xiàng)下制備供試液，液相色譜分析，計(jì)算回收率。結(jié)果，天麻素在0.033 mg、0.131 mg和0.328 mg 3個(gè)水平的平均回收率均在95%~105%，RSD<5%，回收率測試結(jié)果見表1。

表1　頭痛寧膠囊中天麻素測定的加標(biāo)回收率結(jié)果

2.12樣品含量測定 選用5批不同批號(hào)的頭痛寧膠囊，參照2.3項(xiàng)下供試液制備方法制備后HPLC分析，結(jié)果5批樣品中天麻素含量分別為0.48~0.51 mg/粒，結(jié)果見表2。參照中國藥典要求[4]，天麻中天麻素含量不能低于0.2%，頭痛寧膠囊制劑標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定每粒膠囊中應(yīng)含有0.27g天麻或天麻的提取物，以80%的轉(zhuǎn)移率計(jì)，制劑中天麻素不應(yīng)少于0.43 mg/粒。

表2　樣品中天麻素的測定結(jié)果　（n=6）

3　討論

天麻素屬于酚甙類物質(zhì)，分子量小、極性較大[10]。本研究比較了熱回流和超聲波兩種提取方法，超聲波提取操作簡單、省時(shí)，而且天麻素受熱60℃以上含量會(huì)下降，有新物質(zhì)生成[11-12]，因此采用超聲波法提取。本實(shí)驗(yàn)比較了水、50%乙醇和75%乙醇三種提取溶劑，三種溶劑均能將天麻素提取完全，但水和50%乙醇提取液過濾較困難，故采用75%乙醇做提取溶劑。比較了25、50和100倍提取溶劑的提取效率，50倍提取溶劑即可將天麻素提取完全。考察了超聲波提取時(shí)間和提取溫度，超聲波提取15 min，提取溫度為40℃可完全提取天麻素。因此最終確定提取方法為：用50倍75%乙醇，超聲波提取15 min，提取溫度為40℃。采用本法提取頭痛寧膠囊中的天麻素，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[7-10]方法優(yōu)化色譜條件，比較了甲醇-水和乙腈-水系統(tǒng)，在220n m波長下，乙腈-水系統(tǒng)更易達(dá)到平衡。在水中加入少量醋酸可使得色譜峰峰形更好，最終選用乙腈-0.01%冰醋酸（2∶98）為流動(dòng)相，柱溫40℃，在此條件下，天麻素色譜峰保留時(shí)間約為6.1 min，與鄰近色譜峰分離度良好，天麻素色譜峰峰形良好。

中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的含量測定項(xiàng)首選君藥，天麻為頭痛寧膠囊方中君藥，應(yīng)設(shè)立天麻的有效成分為標(biāo)準(zhǔn)中含量測定項(xiàng)，建議頭痛寧膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加對(duì)天麻主要成分天麻素的含量限值控制，參考本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，建議頭痛寧膠囊中天麻素不應(yīng)少于0.43 mg/粒。本法可以快速分析頭痛寧膠囊中的天麻素，測定結(jié)果不受藥材中其他物質(zhì)的干擾，方法簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，為進(jìn)一步提高頭痛寧膠囊的質(zhì)量控制方法提供參考。