遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)冠心病患者血漿miRNA-21的影響和意義

陳云憲　唐良秋　陳兆基　梁家榮　張社兵　范文茂　陳寶峰　陳錦峰

512026 韶關(guān)，粵北人民醫(yī)院心血管內(nèi)科

遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)適應(yīng)(remote ischemic preconditio-ning，RIPC)是目前預(yù)防缺血再灌注損傷的研究熱點(diǎn)[1]，許多研究表明RIPC具有減輕冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)所引起的再灌注損傷，改善冠心病患者預(yù)后的作用[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)作為廣泛參與調(diào)控細(xì)胞基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼小RNA，在冠心病的發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用，其中miRNA-21在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)。有研究表明，單向剪切力作用能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)miRNA-21，起到改善內(nèi)皮細(xì)胞生理功能，減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷的作用[3]。RIPC必然是具有改變血管血流剪切力的作用，那么RIPC是否具有調(diào)控miRNA-21的表達(dá)水平，從而起到減輕心肌缺血再灌注損傷的作用，目前尚未見相關(guān)報(bào)道，有必要深入研究，進(jìn)一步闡明缺血預(yù)適應(yīng)可能的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用價(jià)值。

1　對(duì)象和方法

1.1　研究對(duì)象

本研究為前瞻性隊(duì)列研究。連續(xù)選取2015年6月至2017年2月在粵北人民醫(yī)院心內(nèi)科住院的冠心病心絞痛患者共165例作為研究對(duì)象，所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)2010年心絞痛診斷指南標(biāo)準(zhǔn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為試驗(yàn)組85例和對(duì)照組80例：試驗(yàn)組男性56例，女性29例，年齡32～78歲，平均(59.0±12.3)歲；對(duì)照組男性48例，女性32例，年齡34～75歲，平均(58.1±11.7)歲。所有患者均行擇期經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)，并置入雷帕霉素藥物涂層支架(上海微創(chuàng)公司Firebird 2支架)，住院期間接受冠心病二級(jí)預(yù)防治療。入選對(duì)象均為首次接受PCI術(shù)，排除各種急慢性感染性疾病、外傷、惡性腫瘤、結(jié)締組織疾病、自身免疫性疾病、嚴(yán)重周圍血管病變、急性腦卒中和嚴(yán)重肝腎功能不全等危重疾病。本研究方案獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)：2016YB11)，入選患者均簽署知情同意書。

1.2　RIPC訓(xùn)練

試驗(yàn)組患者于入院后第2～4天共進(jìn)行訓(xùn)練3 d，訓(xùn)練時(shí)間為上午8～9時(shí)和下午4～5時(shí)，過程由1名醫(yī)生陪同觀察。訓(xùn)練時(shí)將RIPC治療儀(雙臂自動(dòng)治療儀，深圳市華盈泰智能技術(shù)有限公司)的袖帶綁于受試者雙上臂，儀器自動(dòng)充氣加壓至200 mmHg并維持5 min，袖帶放氣并維持5 min，重復(fù)5輪，共50 min。

1.3　血漿miRNA-21檢測(cè)

所有患者均在入院后第2和5天早晨(即缺血預(yù)適應(yīng)前后)空腹抽取靜脈血標(biāo)本，在室溫下靜置半小時(shí)，于1 000 g離心15 min，收集上清分裝在無酶EP管中，80℃保存。使用mirVana miRNA分離試劑盒(Ambion，美國(guó))提取血漿總miRNAs，提取過程按照說明書操作。使用TaqMan MicroRNA試劑盒(Ambion，美國(guó))檢測(cè)提取的總miRNAs中 miRNA-21表達(dá)。主要分以兩個(gè)步驟：(1)反轉(zhuǎn)錄，引物結(jié)合至miRNA 3’端，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；(2)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。包括miRNA-21前向引物，反向引物以及碳氧熒光素顏料標(biāo)記探針。使用U6作為內(nèi)參基因，標(biāo)準(zhǔn)化miRNA含量。每組miRNA-21表達(dá)含量，通過delta-delta Ct公式計(jì)算得出。每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值。

1.4　記錄臨床指標(biāo)和主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events，MACE)

所有患者于入院時(shí)、手術(shù)當(dāng)天早晨及術(shù)后12 h抽血檢測(cè)高敏肌鈣蛋白T(high sensitivity cardiac troponin T，hs-cTnT)，完善心電圖、超聲心動(dòng)圖等常規(guī)檢查。術(shù)中記錄冠狀動(dòng)脈病變情況、置入支架數(shù)目、支架釋放后TIMI血流分級(jí)(0級(jí)：無灌流；1級(jí)：微灌流；2級(jí)：部分灌流；3級(jí)：完全灌流)等。記錄患者術(shù)后6個(gè)月內(nèi)的MACE，包括心原性或全因死亡、急性心肌梗死、心絞痛反復(fù)發(fā)作、惡性心律失常(如室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)、嚴(yán)重心動(dòng)過緩)、支架內(nèi)血栓形成、心原性休克、嚴(yán)重出血和心力衰竭[包括急性心力衰竭或心功能評(píng)定為紐約心臟病學(xué)會(huì)(New York Heart Association，NYHA)心功能分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)]。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　兩組患者一般臨床資料和手術(shù)情況比較

兩組患者的性別構(gòu)成、年齡、冠狀動(dòng)脈病變情況和置入支架數(shù)目比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但試驗(yàn)組患者支架釋放后TIMI 3級(jí)血流比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

2.2　兩組患者血漿miRNA-21和hs-cTnT的變化比較

試驗(yàn)組與對(duì)照組入院后第2天早晨的血漿miRNA-21水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(50.82±9.15比51.10±9.56，P>0.05)，而第5天的血漿miRNA-21水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(86.25±12.24 比 60.52±10.29，t=3.216，P<0.01)；試驗(yàn)組第5天的血漿miRNA-21水平較第2天明顯上升(t=4.113，P<0.01)，而對(duì)照組第5天的血漿miRNA-21水平較前無明顯變化(P>0.05)。試驗(yàn)組PCI術(shù)后12 h的hs-cTnT變化值(術(shù)后12 h水平減去手術(shù)當(dāng)天早晨的水平)明顯低于對(duì)照組[(25.27±21.88)pg/ml 比(38.79±32.46)pg/ml，t=2.162，P<0.01)，見表2。

表1　兩組患者一般臨床資料和手術(shù)情況比較

表2　兩組患者PCI術(shù)前后miRNA-21和hs-cTnT比較

2.3　兩組患者M(jìn)ACE情況

術(shù)后6個(gè)月內(nèi)，試驗(yàn)組有6例患者出現(xiàn)MACE，其中3例心功能衰竭，2例反復(fù)出現(xiàn)心絞痛，1例全因死亡；對(duì)照組有9例患者出現(xiàn)MACE，其中3例心功能衰竭，4例反復(fù)出現(xiàn)心絞痛，1例出現(xiàn)心室顫動(dòng)，1例出現(xiàn)心肌梗死。

2.4　基線miRNA-21水平在出現(xiàn)和未出現(xiàn)MACE的患者間的差異

出現(xiàn)MACE的患者基線miRNA-21水平明顯低于未出現(xiàn)MACE的患者(46.73±10.03比52.12±11.26，t=1.624，P=0.041)。

2.5　多因素logistic回歸分析

將MACE設(shè)為因變量，將可能影響預(yù)后的各種因素設(shè)為自變量，先行單因素分析，結(jié)果顯示基線miRNA-21、術(shù)后TIMI血流分級(jí)、年齡、糖尿病病史、左心室射血分?jǐn)?shù)、術(shù)后12 h的hs-cTnT水平、BNP、心功能NYHA分級(jí)、冠狀動(dòng)脈病變數(shù)目是MACE的危險(xiǎn)因素(均為P<0.05)。利用多因素logistic回歸分析危險(xiǎn)因素對(duì)預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)基線miRNA-21、左心室射血分?jǐn)?shù)、心功能NYHA分級(jí)、冠狀動(dòng)脈病變數(shù)目是冠心病患者PCI術(shù)后6個(gè)月內(nèi)發(fā)生MACE的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均為P<0.05)，見表3。

表3　多因素logistic回歸分析結(jié)果

3　討論

RIPC是目前缺血性心臟病的研究熱點(diǎn)，大量研究表明，RIPC具有減輕心肌缺血再灌注損傷、改善血管內(nèi)皮功能的作用[1，4]。冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)的操作過程會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞造成一定損傷，有學(xué)者通過對(duì)PCI術(shù)后患者進(jìn)行增強(qiáng)心臟磁共振成像檢查發(fā)現(xiàn)，術(shù)后肌鈣蛋白I(cTnI)升高的患者出現(xiàn)新發(fā)不可逆的心肌損失，且損傷程度直接與cTnI的升高程度成正比[5]。Hoole等[6]把接受擇期PCI的患者隨機(jī)分成RIPC組和非RIPC組，并通過檢測(cè)術(shù)后24 h的cTnI水平評(píng)估缺血預(yù)適應(yīng)在PCI中的心臟保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)RIPC組患者術(shù)后的中位cTnI水平明顯低于非RIPC組(P=0.04)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)RIPC組患者術(shù)后出現(xiàn)胸痛及心電圖ST段改變少于非RIPC組。有薈萃分析也證實(shí)了RIPC能減輕PCI術(shù)后心肌再灌注損傷，改善冠心病患者的預(yù)后[7-8]。本研究結(jié)果也提示，接受RIPC的冠心病心絞痛患者擇期PCI術(shù)后12 h的hs-cTnT變化值明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，與上述研究結(jié)果一致，再次驗(yàn)證了RIPC的心臟保護(hù)作用。本研究追蹤了所有行擇期PCI術(shù)的心絞痛患者6個(gè)月內(nèi)的MACE情況，并未發(fā)現(xiàn)兩組有顯著差異，但試驗(yàn)組的MACE發(fā)生率有減少趨勢(shì)，可能需要更大的樣本量證實(shí)RIPC對(duì)冠心病患者預(yù)后的影響。

miRNAs是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，廣泛參與心臟發(fā)育和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[9]。miRNA-21是一種高度表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞的基因調(diào)節(jié)因子，在缺血性心臟病中發(fā)揮著重要的生理作用。Dong等[10]發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在急性心肌梗死小鼠模型中的心臟梗死區(qū)表達(dá)明顯下降，在梗死邊界區(qū)高表達(dá)，而缺血預(yù)適應(yīng)能提高心肌梗死區(qū)miRNA-21的表達(dá)水平。通過腺病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)miRNA-21能明顯減少大鼠心肌梗死面積，并且減少左心室容積，證實(shí)miRNA-21對(duì)缺血誘發(fā)的細(xì)胞凋亡起到保護(hù)作用。研究者認(rèn)為，miRNA-21可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性死亡基因4和多個(gè)心肌保護(hù)介質(zhì)，包括激活蛋白1、內(nèi)皮型一氧化氮合酶、熱休克蛋白70和熱休克轉(zhuǎn)錄因子1等起到心肌和血管內(nèi)皮的保護(hù)作用[3]。也有研究表明，外周血miRNA-21水平與冠心病患者冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[11]。Weber等[12]通過單向剪切力作用利用臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)miRNA-21在有剪切力組比對(duì)照組表達(dá)增加了5.2倍，過表達(dá)miRNA-21后發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡比正常對(duì)照組明顯減少。有研究表明[13]miRNA-21在急性STEMI患者血漿中、泡沫細(xì)胞及AS斑塊內(nèi)的水平明顯升高，過表達(dá)miR-21及沉默其靶基因程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)可抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮抗AS的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，RIPC組患者的血漿miRNA-21表達(dá)水平明顯升高，可能是因?yàn)镽IPC改變血管內(nèi)皮的剪切力，引起血管內(nèi)皮表達(dá)miRNA-21增加。本研究還發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)MACE的患者血漿miRNA-21表達(dá)水平明顯下降，多因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)基線miRNA-21是冠心病患者PCI術(shù)后6個(gè)月內(nèi)MACE的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，提示血漿miRNA-21水平可能是評(píng)估冠心病患者預(yù)后的重要標(biāo)志物。

綜上所述，RIPC對(duì)冠心病患者的血管內(nèi)皮功能和心肌缺血再灌注損傷具有良好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制之一可能是通過調(diào)控miRNA-21的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的。miNRA-21通過調(diào)控靶基因起到重要的心臟保護(hù)作用，可能是缺血性心臟病的重要標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，在多種心臟疾病上有著良好的臨床應(yīng)用前景。目前RIPC的最佳療程并不清楚，此外RIPC對(duì)miRNA-21的調(diào)節(jié)機(jī)制仍然需要更多的基礎(chǔ)研究加以證實(shí)。

利益沖突：無