粉碎細(xì)度對桑葉粉功能成分溶出的影響

李 玲 丁曉雯 趙 威 張高軍 黃先智

(1. 西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715；2. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715;3. 西南大學(xué)蠶學(xué)與生物系統(tǒng)研究所，重慶 400715)

桑葉為桑科植物桑(MorusalbaL.)的葉，現(xiàn)代藥理研究[1]證明，桑葉含有黃酮、多酚、多糖、氨基酸、DNJ、膳食纖維等活性物質(zhì)，有降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、抗菌和抗病毒等多種藥理活性。目前中國的桑葉類保健產(chǎn)品主要是桑葉茶、桑葉咀嚼片、桑葉干粉、桑葉掛面等，不為大眾所熟知[2]，桑葉開發(fā)尚有巨大的發(fā)展空間。

桑葉的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)使桑葉中的活性成分要經(jīng)過浸潤、溶脹、滲透和擴(kuò)散等幾個步驟才可以溶出[3]，限制了桑葉有效成分的利用率，將桑葉粉碎是提高其溶出率的有效途徑[4]。超微粉碎是指將物料粉碎至10～25m大小顆粒的新技術(shù)，可以加快功能成分溶出效率[5]。研究[6-7]表明，超微粉碎可以顯著降低桑葉粉粒徑，增加蛋白質(zhì)、多糖與鈣溶解性，但對其他有效成分的研究較少。

本試驗通過研究3種細(xì)度桑葉粉的DNJ、黃酮、總酚、多糖、氨基酸和膳食纖維的溶出情況，為其大規(guī)模開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

桑葉粉：3種細(xì)度的勝利大葉桑葉粉，由西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)重點實驗室提供。

1.2 試驗試劑與儀器

DNJ標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津公司；

全自動凱氏定氮儀：UDK132型，意大利VELP公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 粒徑分布與顯微結(jié)構(gòu)的測定 取0.01 g桑葉粉樣品置于載玻片上，滴1滴稀甘油分散，使用顯微鏡法測量粒徑并觀察纖維特征[8]。

1.3.2 DNJ的測定

(1) 配制1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液：0，5，10，15，20，25，30 μg/mL。

(2) 制備待測樣品：每個待測樣本稱取6份，每份0.5 g，分別加入35 mL超純水，80 ℃水浴浸提20，40，60，80，100，120 min(每20 min振搖1次)，使用10～15 μm孔徑的慢速定性濾紙抽濾，濾渣再加15 mL超純水重復(fù)提取1次，合并2次濾液用超純水定容至50 mL。DNJ測定方法參考文獻(xiàn)[9]。

1.3.3 黃酮的測定

(1) 配置蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：0，50，150，250，350，450 μg/mL。

(2) 制備待測樣品：每個待測樣本稱取6份，每份1.0 g，加入30 mL甲醇，60 ℃水浴條件下分別浸提10，20，30，40，50，60 min，10～15 μm孔徑的慢速定性濾紙抽濾，濾渣再重復(fù)提取2次，合并濾液，以甲醇定容至100 mL。黃酮測定方法參考文獻(xiàn)[10]。

1.3.4 總酚的測定

(1) 配置沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.00，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16 mg/mL。

(2) 制備待測樣品：每個桑葉樣品準(zhǔn)確稱取6份，每份1.0 g，加入100 mL純水搖勻，室溫分別浸提0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，10～15 μm孔徑的慢速定性濾紙抽濾，純水定容至100 mL。總酚測定方法參考文獻(xiàn)[11]。

1.3.5 多糖的測定

(1) 配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 μg/mL。

(2) 制備待測樣品：每個樣稱取6份，每份0.25 g，加入25 mL的沸純水，80 ℃水浴提取20，40，60，90，120，180 min，10～15 μm孔徑的慢速定性濾紙抽濾，取濾液用純水定容至25 mL。取1.0 mL濾液于50 mL容量瓶中，用純水定容。多糖測定方法參考文獻(xiàn)[12]。

1.3.6 氨基酸態(tài)氮的測定 按GB/T 5009.235—2016執(zhí)行。

1.3.7 膳食纖維的測定 按GB 5009.88—2014執(zhí)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同細(xì)度桑葉粉的粒徑與顯微形態(tài)

2.1.1 粒徑 粉碎可以分為粗粉碎、細(xì)粉碎、微粉碎、超微粉碎，其成品粒度分別為5～10 mm、0.1～5.0 mm、<100 μm、10～25 μm[13]。本試驗所用桑葉粉的粒徑分布見表1。

表1 桑葉粉的粒徑Table 1 The particle size of mulberry leaves

根據(jù)粒徑分析的結(jié)果，細(xì)粉、微粉和超微粉的D50%分別為101.00，13.31，8.70 μm，3種桑葉粉分別符合細(xì)粉碎、微粉碎和超微粉碎的成品粒度級別，可以將桑葉粉1號歸為細(xì)粉、2號歸為微粉，3號歸為超微粉。

與細(xì)粉比較，微粉、超微粉的粒徑分別減小58.30%，72.22%；微粉和超微粉的峰度分別增大62.92%，183.71%，峰度增大表示粉碎后粉體粒徑分布更集中。粉碎后微粉與超微粉粒徑的全距分別減小88.74%，93.11%，表示粉碎后粉體粒徑的分布范圍更狹窄，粉體更均勻。

2.1.2 顯微形態(tài) 圖1顯示，在顯微鏡下桑葉細(xì)粉中可見較大的組織塊，這些組織塊由很多結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞組成，表示細(xì)粉的粉碎未達(dá)到使細(xì)胞破碎的程度；微粉中偶見多細(xì)胞的組織殘片，少量的細(xì)胞碎片散布周圍，達(dá)到部分細(xì)胞破碎的程度；而超微粉中未見細(xì)胞群，只有散落的細(xì)胞殘片，沒有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在，達(dá)到了細(xì)胞破碎級別。

圖1 3種桑葉粉的顯微形態(tài)Figure 1 Microscopic morphology of three kinds of mulberry leaf (×200)

2.2 不同細(xì)度桑葉粉的化學(xué)成分溶出量

2.2.1 DNJ溶出量 DNJ是在桑樹中發(fā)現(xiàn)的一種生物堿，已被證明可以通過抑制α-葡萄糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖醛酸酶和糖原磷酸酶等糖代謝酶，顯著延緩多糖的降解過程[14]，有降血糖、抗病毒和抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[15]。測定了3個不同細(xì)度桑葉粉的DNJ溶出量，進(jìn)行了3次重復(fù)，結(jié)果見圖2與表2。

如圖2所示，在各個提取時間，超微粉和微粉的DNJ溶出量都高于細(xì)粉。表2顯示，與桑葉細(xì)粉相比，微粉、超微粉的DNJ平均溶出量與最大溶出量均極顯著增大(P<0.01)；與微粉相比，超微粉的最大溶出量顯著增大(P<0.05)，但二者的平均溶出量無顯著性差異(P>0.05)。表明粉碎可以提高桑葉粉的DNJ溶出量。

圖2 不同細(xì)度桑葉粉DNJ的溶出量Figure 2 Contents of DNJ in different fineness mulberry leaf表2 不同細(xì)度桑葉粉DNJ溶出數(shù)據(jù)統(tǒng)計?Table 2 The data statistics of DNJ dissolves

分組平均溶出量/(mg·g-1)最大溶出量/(mg·g-1)與提取時間相關(guān)系數(shù)相關(guān)顯著性(P值)細(xì)粉 0.90±0.15A1.06±0.01A0.9520.000微粉 2.02±0.73 B2.18±0.03Ba0.5260.025超微粉2.20±0.16B2.28±0.04Bb0.1040.682

? 同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖2顯示，隨著提取時間的延長，細(xì)粉的DNJ溶出呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢，微粉和超微粉的DNJ溶出初始階段增幅比細(xì)粉小，提取時間的延長對DNJ溶出影響不大。表2顯示，細(xì)粉中的DNJ溶出與提取時間極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.952，微粉的DNJ溶出與提取時間極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)比細(xì)粉小，為0.526，超微粉的DNJ溶出與提取時間沒有顯著性相關(guān)關(guān)系。表明粉碎可以使桑葉粉的DNJ在較短時間內(nèi)達(dá)到溶出峰值。

2.2.2 黃酮溶出量 黃酮類物質(zhì)是桑葉的主要活性成分之一，被證明具有明顯的降血脂、降血糖、降血壓、抗氧化作用[16]，對于高脂血癥誘導(dǎo)的糖尿病及心血管系統(tǒng)疾病有一定防治作用[17]。測定了3個不同細(xì)度桑葉粉的黃酮溶出量，進(jìn)行了3次重復(fù)，結(jié)果見圖3與表3。

圖3顯示，在不同提取時間，桑葉細(xì)粉、微粉、超微粉的黃酮溶出量始終呈現(xiàn)出細(xì)粉<微粉<超微粉，超微粉的黃酮溶出量始終大約是細(xì)粉的2倍。由表3可知，3種細(xì)度的桑葉粉的黃酮平均溶出量在各提取時間內(nèi)的均值均有極顯著性差異(P<0.01)；微粉和超微粉的黃酮最大溶出量都極顯著大于細(xì)粉的(P<0.01)，但二者之間無顯著性差異(P>0.05)。表明粉碎可以提高桑葉粉的黃酮溶出量。由圖3可知，隨著提取時間的延長，3種細(xì)度桑葉粉的黃酮溶出量均呈現(xiàn)出先增加后趨于平緩的趨勢，提取時間在40 min后，3種桑葉粉的黃酮溶出量穩(wěn)定在了最大值。微粉的黃酮溶出量在提取時間為30 min內(nèi)與細(xì)粉接近，40 min后與超微粉接近。表3還可以看到，三者的黃酮溶出量與提取時間都極顯著相關(guān)(P<0.01)，但細(xì)粉的相關(guān)系數(shù)大于微粉和超微粉的。表明粉碎可以提高桑葉粉中黃酮的溶出效率。

圖3 不同細(xì)度桑葉粉的黃酮溶出量Figure 3 Contents of flavone in different fineness mulberry leaf表3 不同細(xì)度桑葉粉黃酮溶出數(shù)據(jù)統(tǒng)計?Table 3 The data statistics of flavone dissolves in different fineness mulberry leaf

分組平均溶出量/(mg·g-1)最大溶出量/(mg·g-1)與提取時間相關(guān)系數(shù)相關(guān)顯著性(P值)細(xì)粉 0.53±0.07A0.59±0.03 A0.9240.000微粉 0.63±0.11B0.75±0.02B0.8760.000超微粉0.72±0.07C0.78±0.03B0.8310.000

? 同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2.3 總酚溶出量 桑葉中的多酚類化合物可以清除體內(nèi)過剩的自由基，防止細(xì)胞組織受到氧化傷害，達(dá)到抗衰老、抗輻射、防治腫瘤及增加機(jī)體免疫力等效果[18]。測定了3個不同細(xì)度桑葉粉的總酚溶出量，進(jìn)行了3次重復(fù)，結(jié)果見圖4與表4。

圖4 不同細(xì)度桑葉粉的總酚溶出量Figure 4 Contents of total phenols in different fineness mulberry leaf表4 不同細(xì)度桑葉粉總酚溶出數(shù)據(jù)統(tǒng)計?Table 4 The data statistics of total phenols dissolves in different fineness mulberry leaf

分組平均溶出量/(mg·g-1)最大溶出量/(mg·g-1)與提取時間相關(guān)系數(shù)相關(guān)顯著性(P值)細(xì)粉 7.35±0.16A7.53±0.07a0.7090.001微粉 7.50±0.09B7.57±0.120.1610.523超微粉7.84±0.09C7.80±0.14 b0.0240.923

? 同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由圖4可知，在不同的提取時間下，桑葉粉的總酚溶出始終遵循細(xì)粉<微粉<超微粉的規(guī)律。表4顯示，3種細(xì)度的桑葉粉總酚的平均溶出均有極顯著性差異(P<0.01)；超微粉的總酚最大溶出量顯著高于細(xì)粉(P<0.05)的。表明粉碎可以增大桑葉粉中的總酚在各提取時間內(nèi)的平均溶出量，對其最大溶出量影響較小。

圖4與表4顯示，細(xì)粉的總酚溶出量與提取時間極顯著相關(guān)(P<0.01)，提取時間越長總酚溶出量越大；而微粉和超微粉的總酚溶出量與提取時間沒有顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)，在初始提取時間(0.5 h)即可達(dá)到溶出峰值。因此，粉碎可以使桑葉總酚在較短時間達(dá)到最大溶出量，提高溶出效率。

2.2.4 多糖溶出量 桑葉多糖具有顯著的調(diào)節(jié)糖代謝、降血糖和抑制血脂升高的作用[19]，而且具有抗氧化性，對DPPH·和OH·具有顯著清除作用[20]。測定了3個不同細(xì)度桑葉粉的多糖溶出量，進(jìn)行了3次重復(fù)，結(jié)果見圖5與表5。

圖5 不同細(xì)度桑葉粉的多糖溶出量Figure 5 Contents of polysaccharide in different fineness mulberry leaf表5 不同細(xì)度桑葉粉多糖溶出數(shù)據(jù)統(tǒng)計?Table 5 The data statistics of polysaccharide dissolves in different fineness mulberry leaf

分組平均溶出量/(mg·g-1)最大溶出量/(mg·g-1)與提取時間相關(guān)系數(shù)相關(guān)顯著性(P值)細(xì)粉 8.55±4.54A16.17±0.53A0.8930.000微粉 15.09±4.19 Ba19.21±0.42 Ba0.9500.000超微粉18.27±3.44 Bb22.08±0.94 Bb0.9390.000

? 同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖5顯示，粒度越小，桑葉粉中的多糖溶出量越多，呈現(xiàn)細(xì)粉<微粉<超微粉的規(guī)律。從表5中可以看到，微粉和超微粉的多糖平均溶出量與最大溶出量均極顯著大于細(xì)粉(P<0.01)，超微粉的多糖平均溶出量與最大溶出量均顯著大于微粉(P<0.05)。表明粉碎可以提高桑葉粉中多糖的溶出量。

隨著提取時間的延長，各細(xì)度桑葉粉的多糖溶出量均有不同程度上升，細(xì)粉的多糖溶出量在提取時間終點180 min時趨于平衡，而微粉、超微粉分別在90，60 min時趨于平衡，因此達(dá)到平衡所需要的時間細(xì)粉>微粉>超微粉，顯示粉碎可以加快多糖溶出速率。

DNJ、黃酮、總酚、多糖的溶出量經(jīng)過粉體提高的原因可能是：① 小顆粒與溶劑的接觸面積較大，在相同的時間內(nèi)可以溶出更多的有效成分；② 桑葉粉中的有效成分在溶出的過程中，首先需要吸水溶脹，然后通過簡單擴(kuò)散的方式逐步擴(kuò)散到濃度較低的外層細(xì)胞，若顆粒較大，則其中的有效成分需要經(jīng)過幾十層的“障礙”才可以溶出至溶劑，簡單擴(kuò)散的速度依賴于各級細(xì)胞間的濃度差，達(dá)到溶出最大值時簡單擴(kuò)散不再發(fā)生，溶劑與各級細(xì)胞間濃度差消失，細(xì)胞內(nèi)的有效成分濃度等于溶劑內(nèi)的有效成分濃度，過濾后，濾渣中殘留的有效成分會損失。超微粉碎使細(xì)胞破碎，這些破碎的細(xì)胞沒有胞內(nèi)濃度差，在溶出終點過濾的時候不會截留有效成分。因此增大了DNJ、黃酮、總酚、多糖的最大溶出量。

2.2.5 氨基酸態(tài)氮溶出量 桑葉中含有豐富的氨基酸，干物質(zhì)中的含量約為21%～27%[21]。測定了3個不同細(xì)度桑葉粉的氨基酸態(tài)氮溶出量，進(jìn)行了3次重復(fù)，結(jié)果見表6。

表6 不同細(xì)度桑葉粉的氨基酸態(tài)氮溶出量?Table 6 Contents of amino acid nitrogen in different fineness mulberry leaf

? 同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表6可知，3種細(xì)度桑葉粉的氨基酸態(tài)氮溶出均有極顯著性差異(P<0.01)，粉碎提高了桑葉粉的氨基酸態(tài)氮溶出量。桑葉中大部分的氨基酸以蛋白質(zhì)大分子的形式存在，游離的氨基酸比較少，經(jīng)過粉碎后部分大分子的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，釋放出了游離氨基酸，有利于動物對于氨基酸的吸收。

2.2.6 膳食纖維含量 測定了3個不同細(xì)度桑葉粉的膳食纖維含量，進(jìn)行了3次重復(fù)，結(jié)果見表7。

表7 不同細(xì)度桑葉粉的膳食纖維含量?Table 7 Dietary fiber content of different fineness mulberry leaf powder g/100 g

? 同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

表7顯示，隨著桑葉粉細(xì)度的減小，總膳食纖維(DF)，可溶性膳食纖維(SDF)含量增大，不溶性膳食纖維(IDF)含量減小，三者均具有極顯著性差異(P<0.01)。顯示粉碎可以增加膳食纖維與可溶性膳食纖維含量，減少不溶性膳食纖維含量。

原因可能是不溶的大分子IDF結(jié)構(gòu)在粉碎過程中遭到破壞，轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇艿男》肿覵DF，因此IDF含量減少，而SDF含量增大；還可能是粉碎破壞了植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使得SDF更容易在膳食纖維測定中的酶解過程解離出來，造成SDF含量增加。

3 結(jié)論

粉碎可以使桑葉粉中DNJ、黃酮、總酚、多糖的溶出量顯著增大(P<0.05)，氨基酸態(tài)氮、可溶性膳食纖維、總膳食纖維含量顯著增大(P<0.05)，不溶性膳食纖維含量減小(P<0.05)。綜上，粉碎有利于桑葉粉的有效成分溶出，提高桑葉粉利用率。但是，本研究中不同成分溶出情況是在該成分的最佳提取試劑中測定的，在人體胃腸道中溶出的情況還需要進(jìn)一步探討。