蟲紋鱈鱸線粒體COI基因片段的克隆與序列分析

蟲紋鱈鱸線粒體COI基因片段的克隆與序列分析

對蟲紋鱈鱸(Maccullochellapeelii)線粒體DNA細胞色素氧化酶I亞基(cytochrome oxidase subunit I，COI)基因進行了擴增、克隆和測序，并對COI序列進行了分析。結果顯示，澳洲蟲紋鱈鱸COI基因序列長度為652bp，A、C、T、G 4種堿基平均比例分別為25.3%、16.6%、32.9%、25.2%，A+T比例 (58.2%)明顯高于G+C (41.8%)。與從GenBank中查到的其他6種真鱸科魚類的同源序列比對，并采用最大簡約法(MP)構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示：7種真鱸科魚類聚在一起，分為2個大的支系，麥鱈鱸屬魚類聚為一支，麥氏鱸屬、鱖屬和花鱸屬的魚類聚為一支。其中，花鱸屬的花鱸與鱖屬魚類親緣關系較近，與其他兩屬關系稍遠。所得的聚類結果與傳統(tǒng)的形態(tài)分類基本一致。

蟲紋鱈鱸(Maccullochellapeelii)；COI基因；克??；序列分析

蟲紋鱈鱸(Maccullochellapeelii)隸屬硬骨魚綱(Osteichthyes)鱸形目(Perciformes)真鱸科(Percichthyidae)麥鱈鱸屬(Maccullochella)，原產于澳大利亞東南部墨瑞達令河流域。此魚為世界上最大淡水魚之一，生長速度快、環(huán)境適應力強、繁殖力強。不僅適合水產養(yǎng)殖，亦可做觀賞魚。目前國內雖有幾家單位引進了蟲紋鱈鱸，但有關研究尚少，主要集中在其生物學特性及馴化養(yǎng)殖等方面[1-4]，對其線粒體DNA(mtDNA)的研究尚未見報道。

COI基因是線粒體氧化呼吸鏈的重要成員，進化速度快，包含的遺傳進化信息量大，在魚類群體遺傳結構和系統(tǒng)進化等領域應用較廣[5-7]。本研究對引進蟲紋鱈鱸mtDNA COI基因序列片段進行了擴增和測序，并對其序列特征進行了分析，結合GenBank中已報道的其他6種真鱸科魚類COI基因的同源序列進行了比較，以期為蟲紋鱈鱸的種質資源和遺傳育種研究提供背景資料，并為真鱸科魚類分類和系統(tǒng)進化提供分子生物學上的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用蟲紋鱈鱸樣本取自山東濟南羅非魚國家級良種場東溫室水泥池，由山東省淡水水產研究所從澳大利亞引進。每個個體取新鮮肌肉，于-70℃超低溫冰箱中保存待用。

1.2 總DNA的提取與檢測

取100mg樣品低溫下剪碎并研磨為糊狀，采用生工生物工程(上海)股份有限公司的UNIQ-10柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA，保存于-20℃冰箱用于PCR擴增。

1.3 PCR擴增

采用已報道的一對通用引物擴增蟲紋鱈鱸COI基因。引物序列分別為：COIa：5’-AGTATAAGCGTCTGGGTAGTC-3’和COIf：5’-CCTGCAGGAGGAGGAGAYCC-3’[8]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用TaKaRa公司的TP650型PCR擴增儀擴增，PCR總反應體積為50μl，反應體系為：10×buffer 5μl，25mmol/L的MgCl24μl，2.5mmol/L的dNTP 4μl，引物(各10μmol/L)為2μl，DNA模板2μl，Taq酶(TaKaRa，5U/μl)0.4μl，由滅菌雙蒸水補足至終體積。擴增程序為：94℃預變性2min，然后進行35個循環(huán)(94℃1min，56℃1min，72℃1min)，72℃延伸5min。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳法檢測，凝膠成相系統(tǒng)觀察、照相。

1.4 PCR產物純化與目的片段的克隆

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目的條帶，用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收純化，取目的片段與pMD-18T-Vector(TaKaRa)重組，并轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細菌，通過藍白斑篩選挑取陽性克隆，挑選白色單菌落接種于含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，挑選3個經PCR檢測合格的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 序列分析

測得序列通過Clustal X(Version1.83)軟件進行多序列比對和分析[9]，采用MEGA5.0[10]軟件分析序列的堿基組成和變異位點。從GenBank中搜索到真鱸科其他6種魚類：艾氏麥鱈鱸(Maccullochellaikei)、圓尾麥氏鱸(Macquariaambigua)、叉尾麥氏鱸(Macquariacolonorum)、鱖魚(Sinipercachuatsi)、斑鱖(Sinipercascherzeri)和花鱸(Lateolabraxjaponicus)的COI基因片段序列，采用采用最大簡約法(MP)構建系統(tǒng)進化樹。系統(tǒng)樹中各結點的置信度由自引導值(Bootstrap value)估計，重復次數為1000。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增及膠回收純化結果

蟲紋鱈鱸線粒體COI基因經通用引物特異擴增，所有樣品均擴增出700bp左右的一條整齊而清晰的條帶，未發(fā)現非特異性條帶，對照組未檢測到擴增產物(圖 1)，可以排除外源DNA 污染及核DNA 拷貝的可能性。PCR產物經生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收純化，得到了純度較高的COI基因片段，電泳結果如圖2所示。

C:對照；M:Marker(DL2000)；1～5：樣品

M:Marker(DL2000)；1～5：樣品

2.2 陽性克隆檢測結果

挑取的菌斑經擴大培養(yǎng)和PCR擴增，所得PCR產物在1%的瓊脂糖上電泳，結果如圖3所示，瓊脂糖電泳檢測的5個樣品都擴增成功，且對照組的產物要比試驗組產物的片段小300bp左右，說明目的片段已經連接轉化到大腸桿菌中，陽性克隆比例比較高。

1～5：對照組(COIF和COIR引物)；1’～5’：試驗組(M13F和M13R引物)；M：DL2000

2.3 COI基因片段的序列特征

將所測澳洲蟲紋鱈鱸的mtDNA COI基因片段在除去引物及部分端部序列后，經比對，獲得澳洲蟲紋鱈鱸線粒體COI基因序列5’端的長度為652bp(圖4)。A、C、T、G 4種堿基在3個個體中的平均比例為25.3%、16.6%、32.9%、25.2% ，A+T 比例(58.2%)高于G+C (41.8%)。所測序的3個樣本中僅有1處堿基變異，位于220bp處，堿基A轉換成了G。

圖4 蟲紋鱈鱸COI基因片段核苷酸序列

2.4 系統(tǒng)進化樹的構建

為比較澳洲蟲紋鱈鱸和已報道的真鱸科其他魚類線粒體DNA COI基因的序列差異，從GenBank中下載了6種其他真鱸科4屬魚類的COI序列進行比對，獲得隸屬于真鱸科4屬共7種魚類527bp的同源序列(含插入/缺失位點)。其他6種真鱸科魚類的COI基因序列的長度及其登錄號詳見表1。

表1 幾種真鱸科魚類COI基因序列的長度及其登錄號

注：枝上顯示bootstrap 1000個循環(huán)的置信度

采用最大簡約法(MP)構建了真鱸科科7個種的系統(tǒng)樹，系統(tǒng)樹各結點的支持率以序列數據集1000次重復抽樣檢驗的自引導值(Bootstrap value)表示，各分支上的數字為重抽樣分析得到的大于50的支持率。由系統(tǒng)進化樹的拓撲結構(圖5)可知，7種魚類聚成2個大的分支：鱖屬2種魚類首先聚在一起與花鱸屬的花鱸聚為一個亞群，然后再與麥氏鱸屬2種魚類聚為一支；而蟲紋鱈鱸3個個體先聚在一起，然后再與同屬于麥鱈鱸屬的艾氏麥鱈鱸聚成一支，表現為與形態(tài)學分類結果基本一致，說明mtCOI基因適合于物種間親緣關系及系統(tǒng)進化的研究。

3 討論

線粒體DNA是共價閉合的雙鏈分子，其結構簡單、進化速度快、幾乎不發(fā)生重組、呈嚴格的母系遺傳，已成為一種應用較廣的分子標記[11]。線粒體DNA不同的區(qū)域進化速度存在差異，適合不同水平的進化研究[12]，COI基因該基因近年來在魚類群體遺傳結構和系統(tǒng)進化方面有較多的研究[13-16]。

本研究對澳洲蟲紋鱈鱸線粒體DNA COI基因部分片段序列進行了PCR特異性擴增，得到652bp的堿基序列，其中A、C、T、G 4種堿基在3個個體中的平均比例為25.3%、16.6%、32.9%、25.2%。堿基T含量最高，C的含量最低，A+T (58.2%) 含量明顯高于G+C (41.8%)，符合脊椎動物 mtDNA COI堿基組成的特點[17]。通過對澳洲蟲紋鱈鱸COI基因片段遺傳特征的研究，發(fā)現其在種內的變異比較低，所測3個樣本堿基序列基本一致，僅有1處變異。在mtDNA的基因序列中，由于受到的選擇壓力不同導致各個區(qū)域進化速率不同[18]。張巖等[19]對2種黃蓋鰈線粒體DNA3個蛋白編碼基因的系統(tǒng)發(fā)育信息研究指出核苷酸替代速率最快的是D-loop，COI和Cyt b核苷酸替代速率基本一致。Zardoya等[20]研究了脊椎動物的13個蛋白編碼基因所包含的系統(tǒng)發(fā)育信息情況指出，ND4、ND5、Cyt b和COI含有良好的系統(tǒng)發(fā)育信息。彭士明等[21]采用線粒體D-loop區(qū)與COI基因序列比較分析了養(yǎng)殖與野生銀鯧群體遺傳多樣性，基于D-loop序列的分子方差(AMOVA)分析顯示養(yǎng)殖與野生銀鯧群體間具有較高的遺傳分化，而基于COI基因片段AMOVA分析顯示兩群體間并無明顯的遺傳分化，說明線粒體D-loop區(qū)作為反映銀鯧群體間遺傳多樣的敏感度要高于COI基因。本研究中所測3個蟲紋鱈鱸COI基因序列基本一致也同時驗證了COI基因比較保守這一事實，COI基因可能更適用于種間及種以上階元的分析。要進一步了解蟲紋鱈鱸的群體遺傳結構及遺傳多樣性等還需借助其他方法，如對進化速率更快的D-loop區(qū)進行測序分析，或者采用SSR或者AFLP法掃描信息量更大的核DNA。

同時，與從GenBank中查到的其他6種真鱸科魚類的同源序列比對，并采用最大簡約法構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示7種真鱸科魚類聚在一起，分為2個大的支系，鱈鱸屬的2種魚類聚為一支；麥氏鱸屬、鱖屬以及花鱸屬的魚類聚為一支。由聚類結果可知，花鱸屬的花鱸與鱖屬魚類親緣關系較近，與其他兩屬魚類親緣關系稍遠，表現為與形態(tài)學分類結果相一致。

澳洲蟲紋鱈鱸具有生長速度快、環(huán)境適應力強、繁殖力強等特點，養(yǎng)殖前景十分看好。本研究結果為進一步研究澳洲蟲紋鱈鱸的遺傳變異、種群結構和系統(tǒng)進化打下了基礎，但要了解其更多的遺傳背景，尚需借助其他分子生物學手段和資料。

[1]蔡乘成，陳 鵬，張祖興，等.澳洲鱈鱸引種馴化養(yǎng)殖的報告[J].養(yǎng)殖技術顧問，2012，(1)：258-259.

[2]韓茂森.澳洲蟲紋鱈鱸的生物學特性及引養(yǎng)前景[J].淡水漁業(yè)，2003，33(4)：50-52.

[3]王 波，張艷華，韓茂森，等.蟲紋麥鱈鱸的形態(tài)和生物學性狀[J].水產科技情報，2003，(6)： 266-267.

[4]左瑞華，汪學軍.蟲紋鱈鱸苗種培育影響因素初步分析[J].安徽農學通報，2001，7(3)：57-59.

[5]張 迪，雷光春，龔 成，等.基于COI基因序列的太湖新銀魚遺傳多樣性[ J].湖泊科學，2012，24(2)：299-306.

[6]張龍崗，郭金峰，孟慶磊，等.澳洲寶石鱸線粒體DNA COI基因的克隆與序列分析[J].生物技術通報，2011，(4)：116-119.

[7]張鳳英，馬凌波，施兆鴻，等.兩種鯛屬魚類線粒體COI 基因片段序列的比較[J].上海水產大學學報，2006，15(4)：403-408.

[8]Palumbi S R，Benzie J.Large mitochondrial DNA differences between morphologically similarPenaeidshrimp[J].Mol Mar Biol Biotech，1991，1：27-34.

[9]Thompson J D， Higgins D G， Gibson T J.CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through weighting positions-specific gap penalties and weight matrix choice[J].Nucleic Acids Res，1994，22：673-680.

[10] Koichiro Tamura，Daniel Peterson，Nicholas Peterson，et，al.MEGA5：Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood,Evolutionary Distance，and Maximum Parsimony Method [J].Molecular Biology and Evolution，2011，28：2731-2739.

[11]Verheyen E，Salzburger W，Meyer A，et al.Origin of the superflock of cichlid fishes from lake Victoria， East Africa[J].Science，2003，300：325-329.

[12]李詠梅，陳秀荔，彭 敏，等.基于線粒體COI基因序列探討廣西欽州灣牡蠣的遺傳分化[J].西北農林科技大學學報(自然科學版)，2009，37(3)：60-65.

[13]彭士明，施兆鴻，侯俊利，等.銀鯧3 個野生群體線粒體COⅠ基因的序列差異分析[J].上海水產大學學報，2009，18(4)：398-402.

[14]曲憲成，張 勇，劉其根，等.千島湖細鱗鲴種群線粒體COⅠ基因變異及遺傳分化研究[J]湖南農業(yè)科學，2011，(15)：150-153.

[15]柳淑芳，陳亮亮，戴芳群，等.基于線粒體CO1基因的DNA條形碼在石首魚科(Sciaenidae)魚類系統(tǒng)分類中的應用[J].海洋與湖沼，2010，41(2)：223-232.

[16] 郭奕惠，喻達輝，黃桂菊，等.中國主要養(yǎng)殖羅非魚親緣關系的COI序列分析[J].華中農業(yè)大學學報，2009，28(1)：75-79.

[17] Broughton R E，Roe B A.The complete sequence of the zebra fish (Daniorerio) mitochondrial genome and evolutionary patterns in vertebrate mitochondrial DNA [J].Genome Res，2001， 11：1958-1967.

[18] 張鳳英，馬凌波，施兆鴻，等.3種鯧屬魚類線粒體COI基因序列變異及系統(tǒng)進化[J].中國水產科學，2008，15(3)：392-399.

[19]張 巖，肖永雙，高天翔，等.兩種黃蓋鰈線粒體DNA部分片段比較分析[J].水產學報，2009，33(2)：201-207.

[20]Zardoya R，Meyer A.Phylogenetic performance of mitochondrial protein-coding genes in resolving relationships among vertebrates [J].Mol Biol Evol，1996，13：933-942.

[21] 彭士明，施兆鴻，侯俊利.基于線粒體D-loop區(qū)與COI基因序列比較分析養(yǎng)殖與野生銀鯧群體遺傳多樣性[J].水產學報，2010，34(1)：19-25.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.08.009

Q785；Q959.483

A

1673-1409(2012)08-S025-05

2012-08-01

農業(yè)部“948”計劃項目(2011-z41)。

張龍崗(1982-)，男，山東濟寧人，碩士，助理研究員，主要從事魚類遺傳育種研究。

朱永安， E-mail：zhuyongan1965@163.com。