雷公藤內(nèi)酯醇抑制TNF-α表達(dá)對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的影響*

張海峰，張彬，周國雄，陳衛(wèi)昌

（1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006）

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）是潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）主要促炎因子。研究表明，TNF-α在UC血清、局部組織中的表達(dá)明顯升高[1-7]。雷公藤內(nèi)酯醇（Triptolide，TL）是從中藥雷公藤中分離的二萜內(nèi)酯化合物，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用[8-17]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用TL治療UC小鼠，觀察治療前后小鼠的病情變化，以及TL與疾病的相關(guān)性，進(jìn)一步明確TL是否對UC有療效，以及是否與抑制TNF-α的表達(dá)有關(guān)。

1　材料與方法

1.1　材料

選擇4～6周齡SPF級雌性BALB/c小鼠80只，由南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，在南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房按常規(guī)方式喂養(yǎng)。葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt,DSS）（美國 MP Biomedicals公司），TL（中國南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司），Trizol抽提RNA試劑（美國Invitriogen公司），PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），TNF-α多克隆抗體（兔抗小鼠，美國Abcam公司），二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。本實(shí)驗(yàn)已通過南通大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

1.2　方法

1.2.1動(dòng)物模型的復(fù)制按STEVCEVA[18]和張艷麗等[19]的方法復(fù)制DSS實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，除空白對照組外，其他組小鼠飲用5% DSS溶液（5g DSS溶于100 ml蒸餾水）7 d。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組將80只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對照組、生理鹽水組、丙二醇組、地塞米松組、美莎拉嗪組，以及TL 1、2、3組8組，分籠飼養(yǎng)，每籠10只?？瞻讓φ战M：不予任何處理；生理鹽水組：DSS模型復(fù)制成功后腹腔注射生理鹽水0.2 ml/次，1次/d；丙二醇組：腹腔注射20%丙二醇0.2 ml/次，1次/d；地塞米松組：地塞米松0.1 mg/（kg·d）溶于生理鹽水中腹腔注射；美沙拉嗪組：美沙拉嗪20～30 mg/kg溶于水中經(jīng)胃管注入，3次/d；TL 1組：TL溶于20%丙二醇，腹腔注射藥量為0.20 mg/（kg·d）；TL 2組：TL溶于20%丙二醇，腹腔注射藥量為0.40 mg/（kg·d）；TL 3組：TL溶于20%丙二醇，腹腔注射藥量為 0.60 mg/（kg·d）。

1.2.3疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index,DAI）評分各組從第1天開始，每日觀察、記錄小鼠的一般情況，包括精神、活動(dòng)、飲食、體重變化，同時(shí)觀察小鼠的大便性狀及便血情況，分析治療前后結(jié)腸病變的變化。參照MURANO等[20]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DAI評分（見表1）。DAI=（體重下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù)）/3。大便性狀分?jǐn)?shù)分為：①正常大便，可成型顆粒樣大便；②松散便，不與肛門相黏的糊狀糞便或半成形不黏肛便；③稀便，黏于肛門的水樣便。大便隱血檢測采用傳統(tǒng)聯(lián)苯胺法。

1.2.4大體形態(tài)學(xué)評分模型復(fù)制成功后第8天，采用頸椎脫臼法處死各組小鼠，分離整段結(jié)腸組織并縱行剖開結(jié)腸，預(yù)冷生理鹽水沖洗清潔數(shù)次，用濾紙濾干，大頭針展開平鋪，固定結(jié)腸組織。用肉眼觀察結(jié)腸黏膜炎癥及潰瘍發(fā)生情況，參照EKSTROM等[21]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分：黏膜無損害計(jì)0分，黏膜充血計(jì)1分，潰瘍面積＜25%受損面積計(jì)2分，潰瘍面積占25%～50%受損面積計(jì)3分，潰瘍面積＞50%受損面積計(jì)4分。將病變明顯腸段分為3部分：一部分用4%甲醛固定，送病理科，行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色；一部分于 -80℃條件下保存，留做逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）； 另一部分提取蛋白，留做Western blot檢測。

表1　DAI評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5結(jié)腸病理組織學(xué)觀察及評分取病變組織常規(guī)石臘包埋、切片、HE染色，參照BOIRIVANT等[22]的標(biāo)準(zhǔn)行盲法評分，由2位病理科醫(yī)師分別雙盲閱片，結(jié)果取均值進(jìn)行評分。組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)：正常計(jì)0分；極低白細(xì)胞浸潤、＜10%高倍視野（high power field,HPF）計(jì)1分；少量白細(xì)胞浸潤、10%～25% HPF計(jì)2分；中量白細(xì)胞浸潤、25%～50% HPF，同時(shí)伴血管密集和腸壁增厚計(jì)3分；大量白細(xì)胞浸潤、＞50% HPF、血管高度密集、隱窩變形、扭曲計(jì)4分。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）收集血液，3 000 r/min離心 10 min，將血清與紅細(xì)胞分離；3 000 r/min離心30 min取上清，3 000 r/min離心10 min去除顆粒和聚合物。操作步驟：在室溫下平衡20 min后從鋁箔袋中取出所需板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl/孔；樣本孔先加待測樣本10μl，再加樣本稀釋液40μl；空白孔不加。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100μl/孔，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。每孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50μl，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔的OD值。結(jié)果判斷：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

1.2.7RT-PCR取適量病變組織提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行PCR擴(kuò)增。TNF-α正向引物：5’-CCTCAGGAACGGGACTCGAA-3’，反向引物：5’-ATGTACACCAAGTCGGTAGCACCA-3’，擴(kuò)增片段長度86 bp；內(nèi)參照β-actin正向引物：5’-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3’，反向引物：5’-CCACAGGATTCCATACCCAA-3’，擴(kuò)增片段長度446 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，58℃退火25 s，72℃延伸35 s，共循環(huán)45次，于每個(gè)循環(huán)的72℃時(shí)采集熒光數(shù)值。為檢測每個(gè)反應(yīng)的特異性，循環(huán)結(jié)束后分析熔解曲線，分析條件為95℃、15 s，60℃、60 s，95℃、15 s。為消除樣本、逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)的差異，以目的基因TNF-α 和β-actin mRNA含量的比值作為評價(jià)目的基因表達(dá)水平的指標(biāo)。

1.2.8Western blot檢測提取總蛋白，用紫外分光光度法測定總蛋白濃度，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白上樣量20μl/孔。在垂直電泳槽中電泳后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上，5% TBST封閉4 h，加入稀釋的TNF-α一抗（工作濃度1∶2 500）4℃孵育過夜；TBST洗膜10 min/次，共5次，加入稀釋的二抗（工作濃度1∶5 000）孵育2 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光熒光試劑顯影。以β-actin（47 kDa）為內(nèi)參照，用凝膠成像分析系統(tǒng)處理數(shù)據(jù)，以TNF-α（17 kDa）與內(nèi)參照的灰度比值作為蛋白的相對表達(dá)量。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析或單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察

各組小鼠從開始處理后7 d內(nèi)每天固定時(shí)間評估各組小鼠DAI評分，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間的DAI評分有差別（F=37.841，P=0.000）；②各組 DAI評分有差別（F=55.512，P=0.000）；③各組DAI評分變化趨勢有差別（F=29.662，P=0.000）。空白對照組小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)、飲食等一般情況良好，大便性狀正常，體重逐步增加。生理鹽水組、丙二醇組小鼠模型復(fù)制成功后第1、2天開始飲食減少、活動(dòng)能力下降，毛色無光澤、體重減少，同時(shí)排便次數(shù)逐漸增多，大便性狀發(fā)生改變（軟便、稀糊狀、水樣便等）；第3、4天大便隱血或出現(xiàn)暗紅色、鮮紅色血便。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，生理鹽水組、丙二醇組小鼠DAI評分與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.368和24.526，均P=0.000）。TL 2、3組，以及地塞米松組、美莎拉嗪組在復(fù)制模型的同時(shí)給予相應(yīng)治療后，各組小鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，活力明顯增加，飲食及體重較生理鹽水組、丙二醇組下降幅度減少，毛色有改善，便血或大便隱血情況明顯好轉(zhuǎn)，部分大便形態(tài)逐漸恢復(fù)為軟便或者固體便；TL 2、3組，以及地塞米松組、美莎拉嗪組小鼠DAI評分與生理鹽水組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.226、8.880、7.582和8.006，均P=0.000）；TL 2、3組，以及地塞米松組、美莎拉嗪組小鼠DAI評分與丙二醇組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.228、10.663、10.002和 9.445， 均P=0.000）。結(jié)果顯示，TL與地塞米松、美莎拉嗪有類似效應(yīng)，能改善UC小鼠的一般情況。見表2。

表2　各組小鼠不同時(shí)間DAI評分比較（n=10，分，±s）

表2　各組小鼠不同時(shí)間DAI評分比較（n=10，分，±s）

組別　1 d　2 d　3 d　4 d　5 d　6 d　7 d空白對照組　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000　0.000±0.000生理鹽水組　0.292±0.213　0.417±0.154　1.083±0.661　2.167±0.563　3.000±0.642　3.750±0.345　4.002±0.560丙二醇組　0.333±0.000　0.333±0.000　1.000±0.356　2.292±0.602　2.917±0.345　3.708±0.452　4.120±0.602地塞米松組　0.292±0.118　0.292±0.118　0.500±0.436　0.917±0.556　1.617±0.427　2.083±0.345　2.475±0.330美沙拉嗪組　0.292±0.118　0.302±0.120　0.625±0.336　1.017±0.502　1.717±0.489　2.223±0.405　2.575±0.410 TL 1 組　0.250±0.236　0.333±0.178　0.708±0.415　1.542±0.469　2.417±0.345　3.375±0.415　3.875±0.173 TL 2 組　0.250±0.154　0.333±0.178　0.416±0.345　1.325±0.575　1.708±0.603　2.308±0.547　2.917±0.345 TL 3 組　0.333±0.000　0.333±0.000　0.483±0.167　1.417±0.569　1.867±0.793　2.217±0.631　2.767±0.272

2.2　各組小鼠結(jié)腸大體形態(tài)學(xué)評分比較

空白對照組、生理鹽水組、丙二醇組、地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 1、2、3組小鼠結(jié)腸大體形態(tài)學(xué)評分分別為（0.300±0.100）、（3.206±0.306）、（3.022±0.282）、（1.826±0.168）、（1.968±0.204）、（2.632±0.282）、（2.202±0.228）和（2.060±0.202）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.360，P=0.000）?？瞻讓φ战M大部分小鼠結(jié)腸黏膜無充血、糜爛及潰瘍，少部分結(jié)腸黏膜見少許散在充血。生理鹽水組、丙二醇組小鼠直腸及近肛側(cè)結(jié)腸黏膜彌漫性充血、水腫，伴多發(fā)性糜爛、淺表潰瘍，部分潰瘍表面有壞死組織；近口側(cè)結(jié)腸充血水腫、散在糜爛，無明顯潰瘍形成。地塞米松、美莎拉嗪治療組，以及TL 2、3組小鼠近肛側(cè)結(jié)腸黏膜輕、中度充血，水腫，糜爛形成較生理鹽水組、丙二醇組明顯減少，部分散在淺潰瘍；近口端結(jié)腸病變不明顯。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，空白對照組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠結(jié)腸大體形態(tài)學(xué)評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=25.532和25.731，均P=0.000）；TL 2組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠結(jié)腸大體形態(tài)學(xué)評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.442和6.396，均P=0.000）；TL 3組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠結(jié)腸大體形態(tài)學(xué)評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.840和7.844，均P=0.000）。TL能減輕UC小鼠結(jié)腸炎癥。見圖1。

圖1　各組小鼠結(jié)腸大體形態(tài)學(xué)評分比較（n=10，±s）

2.3　各組小鼠結(jié)腸病理組織評分比較

空白對照組、生理鹽水組、丙二醇組、地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 1、2、3組小鼠結(jié)腸病理組織評分分別為（0.750±0.100）、（3.562±0.326）、（3.488±0.302）、（1.666±0.192）、（1.802±0.224）、（2.808±0.282）、（2.020±0.222）和（1.862±0.206）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.358，P=0.000）。HE染色結(jié)果顯示，空白對照組小鼠結(jié)腸上皮結(jié)構(gòu)、腺體結(jié)構(gòu)完整無破壞，黏膜無糜爛及潰瘍形成，部分黏膜下層可見少量中性粒細(xì)胞浸潤；生理鹽水組、丙二醇組小鼠結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)破損，見糜爛及潰瘍形成，黏膜及黏膜下層可見大量的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞、少量中性粒細(xì)胞浸潤，固有層腺體變形、排列紊亂，部分破壞；地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 2、3組小鼠結(jié)腸黏膜可見數(shù)量不等淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，糜爛及潰瘍程度較生理鹽水組、丙二醇組減輕。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，空白對照組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠結(jié)腸病理組織評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=23.325和24.344，均P=0.000）；TL 2組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠結(jié)腸病理組織評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.058和11.078，均P=0.000）；TL 3組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠結(jié)腸病理組織評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.469和12.581，均P=0.000）。TL具有減輕UC小鼠結(jié)腸局部病變損害的作用。見圖2。

2.4　各組小鼠血清TNF-α濃度比較

空白對照組、生理鹽水組、丙二醇組、地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 1、2、3組小鼠血清 TNF-α濃度分別為（173.332±18.288）、（388.302±30.202）、（341.322±31.202）、（195.620±18.208）、（231.408±22.608）、（338.36±18.931）、（243.526±23.462）和（197.066±20.108）pg/ml，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=80.681，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，空白對照組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠血清TNF-α濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.221和13.138，均P=0.000），生理鹽水組和丙二醇組小鼠血清TNF-α濃度較高；TL 2組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠血清TNF-α濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.707和7.086，均P=0.000），TL 2組小鼠血清TNF-α濃度較低；TL 3組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠血清TNF-α濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.908和10.992，均P=0.000），TL 3組小鼠血清TNF-α濃度較低；地塞米松組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠血清TNF-α濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.454和11.408，均P=0.000），地塞米松組小鼠血清TNF-α濃度較低；美沙拉嗪組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠血清TNF-α濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.763和8.068，均P=0.000），美沙拉嗪組小鼠血清TNF-α濃度較低。TL能降低UC小鼠血清TNF-α濃度。

2.5　各組小鼠TNF-α mRNA表達(dá)水平比較

空白對照組、生理鹽水組、丙二醇組、地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 1、2、3組小鼠TNF-α mRNA相對表達(dá)量分別為（1.000±0.000）、（2.332±0.366）、（2.422±0.342）、（1.228±0.142）、（1.426±0.150）、（2.022±0.320）、（1.602±0.202）和（1.582±0.182），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19.500，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，空白對照組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠TNF-α mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.294和11.760，均P=0.000），空白對照組TNF-α mRNA微弱表達(dá)，生理鹽水組和丙二醇組TNF-α mRNA表達(dá)上調(diào)；TL 2組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠TNF-α mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.939和5.839，均P=0.000），TL 2組較低；TL 3組與生理鹽水組、丙二醇組小鼠TNF-α mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.190和6.133，均P=0.000），TL 3組較低。TL可抑制UC小鼠局部組織中TNF-α mRNA過表達(dá)。見圖3。

圖2　各組小鼠病理組織學(xué)圖片（HE染色×200）

圖3　各組小鼠TNF-α mRNA表達(dá)水平比較（n=10，±s）

2.6　各組小鼠TNF-α蛋白表達(dá)水平比較

空白對照組、生理鹽水組、丙二醇組、地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 1、2、3組小鼠TNF-α蛋白相對表達(dá)量分別為（0.020±0.010）、（0.063±0.020）、（0.058±0.018）、（0.028±0.013）、（0.029±0.013）、（0.046±0.018）、（0.032±0.015） 和（0.030±0.014），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=57.301，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，生理鹽水組、丙二醇組與空白對照組小鼠TNF-α蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.439和5.220，均P=0.000），空白對照組小鼠TNF-α蛋白微弱表達(dá)，生理鹽水組、丙二醇組TNF-α表達(dá)上調(diào)；地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 2、3組與生理鹽水組小鼠TNF-α蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.150、4.032、3.507 和 3.823，P=0.004、0.002、0.001和0.001），地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 2、3組TNF-α蛋白表達(dá)水平較生理鹽水組降低；地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 2、3組與丙二醇組小鼠TNF-α蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.822、3.694、3.139 和 3.473，P=0.002、0.002、0.007和0.004），地塞米松組、美沙拉嗪組，以及TL 2、3組TNF-α蛋白表達(dá)水平較丙二醇組降低。TL可抑制UC小鼠局部組織中TNF-α蛋白的合成。見圖4。

圖4　各組小鼠TNF-α蛋白的表達(dá)

3　討論

TL具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，但由于作用機(jī)制的廣泛性及機(jī)體免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性，其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制并不十分清楚。就目前研究結(jié)果可知，其作用機(jī)制主要有抑制T細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡、影響NF-κB活性、抑制腫瘤血管生成、抗氧化和抗脂質(zhì)氧化等[8-17]。

張霞等[16]研究表明，TL可以抑制MOG35-55特異性T細(xì)胞增殖，抑制炎癥細(xì)胞因子IL-17、IFN-γ、TNF-α的表達(dá)，并增加IL-4、TGF-β的表達(dá)水平，同時(shí)抑制Nave T細(xì)胞向致病性Th1和Th17細(xì)胞的分化。蘭雷等[17]研究表明，用TL對三硝基苯磺酸/乙醇性腸炎的大鼠模型進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)TL可減輕該模型的組織學(xué)損傷，下調(diào)促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1及黏附因子ICAM-1的表達(dá)水平；同時(shí)檢測相應(yīng)的NF-κB活性發(fā)現(xiàn)，治療組較模型組明顯受抑，提示TL能抑制NF-κB活化，從而使NF-κB調(diào)控的炎癥介質(zhì)產(chǎn)生減少，大鼠結(jié)腸組織損傷減輕。周鋆等[23]在復(fù)制UC大鼠模型的基礎(chǔ)上，以雷公藤紅素進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)高、低劑量雷公藤紅素均能改善結(jié)腸組織大體和組織學(xué)評分，降低NF-κB、p65，以及TNF-α和TNF-αmRNA的表達(dá)，表明雷公藤紅素對TNBS誘導(dǎo)的大鼠UC具有保護(hù)作用。TAO等[24]研究表明，TL可抑制結(jié)腸上皮下肌纖維母細(xì)胞內(nèi)IL-8、MCP-1、MMP-3的表達(dá)而發(fā)揮抗炎效應(yīng)，其作用機(jī)制主要是抑制IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB激活。TAO等[25]另一項(xiàng)研究結(jié)果表明，TL可以減少TNBS誘導(dǎo)的UC模型小鼠結(jié)腸細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，以及減少膠原蛋白的產(chǎn)生，從而抑制結(jié)腸纖維化病變程度。YU等[26]研究顯示，TL可明顯改善實(shí)驗(yàn)小鼠結(jié)腸炎癥狀，作用機(jī)制可能是抑制TLRs/NF-κB信號通路，認(rèn)為TL可作為Crohn's病的治療方法之一，值得深入研究。LI等[27]研究表明，TL可以通過下調(diào)IL-6/STAT3/SOCS3信號通路抑制IL-17表達(dá)；組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，C3H/HeJBir.IL-10缺失老鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)腸炎癥狀明顯改善。WEI等[28-29]研究表明，給予TL可以明顯減輕IL-10缺失小鼠結(jié)腸炎的炎癥程度和免疫功能紊亂，其機(jī)制可能是抑制IL-6/STAT3、TNF-α/TNFR2信號通路，認(rèn)為TL可能適用于Crohn's病的維持治療。本實(shí)驗(yàn)前期研究結(jié)果表明，分別通過TL、地塞米松治療DSS誘導(dǎo)的UC小鼠，發(fā)現(xiàn)TL能減輕小鼠臨床癥狀，并下調(diào)次級淋巴組織趨化因子的表達(dá)，提示TL可通過抑制SLC的過表達(dá)，而達(dá)到治療UC的目的[30]。

本研究結(jié)果驗(yàn)證，TNF-α在UC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，抑制其過表達(dá)對UC有治療作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)TL 2、3組在給予TL治療后，各組小鼠體重增加，一般情況好轉(zhuǎn)，DAI評分、大體形態(tài)觀察及評分、病理組織觀察及評分均提示小鼠結(jié)腸炎癥狀緩解，結(jié)腸組織局部潰瘍、糜爛好轉(zhuǎn)，結(jié)果提示TL對UC有治療作用，其療效不低于有地塞米松、美沙拉嗪。同時(shí)發(fā)現(xiàn)給予TL治療后，血清TNF-α濃度下降，局部結(jié)腸組織中TNF-α在mRNA和蛋白水平表達(dá)均下調(diào)，提示TL有抑制TNF-α過表達(dá)的作用。筆者認(rèn)為TL具有抑抑制炎癥的作用，對UC有治療作用，可通過抑制TNF-α的過表達(dá)而發(fā)揮療效，但其具體作用機(jī)制仍不明確。進(jìn)一步明確TL在UC中的作用機(jī)制，將對UC的治療，特別是對激素、美沙拉嗪類藥物療效欠佳的UC患者帶來新希望。

綜上所述，TL對UC有治療作用，可能是通過抑制TNF-α的過表達(dá)而發(fā)揮作用，提示TL可能是一種有效的治療UC的方法。