山茶油對(duì)應(yīng)激性及冰乙酸致大鼠胃潰瘍的影響及作用機(jī)制研究

蔡春輝 劉天宇 曹良順 李 巖* 吳崇明*

（1 福建春輝生物工程有限公司，福建 寧德 352100；2 北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081；3 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193）

胃潰瘍是一種全球性的消化系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)主要是胃部疼痛、燒灼，有時(shí)伴有吞酸、惡心、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重的患者可能出現(xiàn)胃穿孔、出血，甚至癌變?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，潰瘍的發(fā)生受到多種因素的影響，包括化學(xué)損傷、氣候環(huán)境、生活習(xí)慣和心理壓力等[1-2]。研究結(jié)果證明，血漿抗氧化因子，如丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）等參與了胃潰瘍的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，是治療胃潰瘍的重要調(diào)節(jié)指標(biāo)[2]。山茶油是我國(guó)特有的木本油脂，富含多種不飽和脂肪酸、山茶苷、茶多酚和角鯊烯等活性成分，是國(guó)際糧農(nóng)組織重點(diǎn)推廣的健康型高級(jí)食用木本植物油，具有食療雙重功能[3-10]。在民間有每日服用山茶油治療胃潰瘍的驗(yàn)方，但迄今為止，其治療胃潰瘍的藥理活性尚缺少現(xiàn)代藥理學(xué)試驗(yàn)的證實(shí)。為此，本研究利用兩種胃潰瘍大鼠模型，即水浸束縛法建立的應(yīng)激性胃潰瘍和用冰乙酸直接刺激導(dǎo)致的胃潰瘍，對(duì)山茶油對(duì)預(yù)防和治療胃潰瘍的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，為應(yīng)用山茶油防治胃潰瘍提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并初步探討了其發(fā)揮抗胃潰瘍功效的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料：雄性Wistar大鼠，8周齡，體質(zhì)量230～260 g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所SPF動(dòng)物房?jī)?nèi)，室溫22～24 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，光線為12 h/12 h明暗循環(huán)。使用小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。山茶油由福建春輝生物工程有限公司生產(chǎn)提供；奧美拉唑腸溶片由阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn)；血清MDA和SOD檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其余化學(xué)和生物試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 水浸束縛致大鼠胃潰瘍模型實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周后，將動(dòng)物隨機(jī)分為5組：模型組（等體積蒸餾水），奧美拉唑組（4 mg/kg），山茶油低、中、高劑量組（0.5、1.0、1.5 mL/kg）。每天灌胃給藥，連續(xù)7 d。于末次給藥后禁食24 h，將其四肢固定于木板上，垂直浸入30 ℃水浴至劍突水平。24 h后取出處死，打開(kāi)腹腔，結(jié)扎胃的幽門(mén)，從賁門(mén)向胃內(nèi)注入1%福爾馬林溶液8 mL后再結(jié)扎賁門(mén)，摘下全胃浸泡于福爾馬林溶液中30 min后，沿大彎將胃剖開(kāi)檢查潰瘍，同時(shí)取血測(cè)量血清指標(biāo)。

1.3 胃潰瘍指數(shù)測(cè)定：將胃用福爾馬林固定后，沿胃大彎剪開(kāi)，生理鹽水漂洗，用濾紙吸干水分，在固定板上將胃展平并用細(xì)針頭固定，觀察潰瘍的情況。按改良Guth標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算潰瘍指數(shù)[001]：病變的最大徑＜1 mm為1分；1～2 mm為2分；2～4 mm為3分；＞4 mm為4分；若病灶寬于2 mm，其長(zhǎng)度乘以2。全胃各病灶評(píng)分之和作為潰瘍指數(shù)。

1.4 乙酸致大鼠胃潰瘍模型實(shí)驗(yàn)：大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行胃潰瘍手術(shù)。腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進(jìn)行麻醉，然后固定于手術(shù)臺(tái)上。常規(guī)消毒，沿劍突向下腹中線剪開(kāi)長(zhǎng)約2 cm的正中切口，將胃輕輕托出至腹外，于胃體與幽門(mén)竇交界處，用0.1 mL冰乙酸涂覆于胃體外側(cè)30 s，然后用無(wú)菌生理鹽水清洗多余乙酸，并縫合傷口。手術(shù)后將動(dòng)物隨機(jī)分為5組：模型組（等體積蒸餾水），奧美拉唑組（4 mg/kg），山茶油低、中、高劑量組（0.5、1.0、1.5 mL/kg）。每天灌胃給藥，連續(xù)7 d。末次給藥后處死動(dòng)物，打開(kāi)腹腔，結(jié)扎胃的幽門(mén)，從賁門(mén)向胃內(nèi)注入1%福爾馬林溶液8 mL后再結(jié)扎賁門(mén)，摘下全胃浸泡于福爾馬林溶液中30 min后，沿大彎將胃剖開(kāi)檢查胃潰瘍，同時(shí)取血測(cè)量血清指標(biāo)。

1.5 胃潰瘍面積測(cè)定：將胃用福爾馬林固定后，沿胃大彎剪開(kāi)，生理鹽水漂洗，用濾紙吸干水分，在固定板上將胃展平。用游標(biāo)卡尺測(cè)潰瘍長(zhǎng)徑（DL）和短徑（DS），大鼠潰瘍面積按照公式S=DL×DS×π/4計(jì)算，π取3.14。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以Mean±SEM表示，用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

圖2 山茶油對(duì)乙酸致大鼠胃潰瘍的促愈合作用（n=10）。（A）典型的胃組織圖片；（B）胃潰瘍面積定量數(shù)據(jù)。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001試驗(yàn)組vs模型組

2.1 山茶油對(duì)水浸束縛致胃潰瘍大鼠的保護(hù)作用：正常大鼠的胃黏膜光滑，呈淡粉色，可見(jiàn)黏膜皺襞，沒(méi)有充血、出血現(xiàn)象。水浸束縛8 h后，模型組胃腔內(nèi)出現(xiàn)咖啡樣物質(zhì)，沖洗后可見(jiàn)胃黏膜表面彌漫性水腫，胃體可見(jiàn)廣泛分布的呈條索狀或點(diǎn)狀的深褐色潰瘍面及出血點(diǎn)。山茶油和奧美拉唑預(yù)防處理可以顯著減輕胃潰瘍病變（圖1A）。胃潰瘍指數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示，水浸束縛導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的應(yīng)激性胃潰瘍，胃潰瘍指數(shù)達(dá)到35.5（圖1B）。奧美拉唑（4 mg/kg）預(yù)防給藥可使胃潰瘍指數(shù)顯著降低（P＜0.01），抑制率為62.73%（圖1B）。每日給予山茶油預(yù)防處理7 d，大鼠胃潰瘍指數(shù)呈劑量依賴(lài)性降低，其中1.5 mL/kg劑量的胃潰瘍抑制率接近陽(yáng)性藥奧美拉唑（57.18% vs.62.73%）（圖1B），顯示出較強(qiáng)的預(yù)防胃潰瘍功效。山茶油對(duì)水浸束縛誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍的抑制率：奧美拉唑62.73%，山茶油低、中、高分別為40.56%、48.73%、57.18%。

圖1 山茶油對(duì)水浸束縛誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍的防治作用（n=10）。（A）典型的胃組織圖片；（B）胃潰瘍指數(shù)定量數(shù)據(jù)。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001試驗(yàn)組vs模型組

2.2 山茶油促進(jìn)乙酸致大鼠胃潰瘍愈合的作用：乙酸涂覆胃體導(dǎo)致大鼠的胃組織產(chǎn)生典型的胃潰瘍病灶，潰瘍病灶與潰瘍邊緣有明顯分界，潰瘍面覆蓋灰白苔，邊緣水腫（圖2A）。與模型組相比，各試驗(yàn)組的潰瘍面積均明顯變小，顯示出促進(jìn)胃潰瘍愈合的效果。胃潰瘍面積測(cè)量結(jié)果顯示，模型組動(dòng)物的胃潰瘍面積達(dá)52 mm2（圖1B）。經(jīng)山茶油治療7 d后，胃潰瘍面積呈劑量依賴(lài)性降低，以1.5 mL/kg的劑量最好，其效果接近陽(yáng)性藥奧美拉唑（圖2B）。山茶油對(duì)乙酸致胃潰瘍大鼠的促愈合率：奧美拉唑66.53%，山茶油低、中、高分別為27.89%、46.97%、60.19%。

2.3 山茶油對(duì)乙酸致胃潰瘍大鼠血清MDA和SOD的影響：為初步探討山茶油治療胃潰瘍的潛在機(jī)制，我們進(jìn)一步考察了山茶油對(duì)動(dòng)物體內(nèi)氧化應(yīng)激的影響。如圖3A所示，山茶油在0.5～1.5 mL/kg的劑量下可以顯著降低乙酸致胃潰瘍大鼠血清中MDA的含量，并具有明顯的量效關(guān)系。同時(shí)，每天灌胃1.5 mL/kg的山茶油可以顯著提高血清SOD的活性（圖3B）。雖然山茶油在0.5和1.0 mL/kg的劑量下未能顯著升高血清SOD活性，但仍然顯示出了一定的量效關(guān)系（圖3B）。這些結(jié)果提示，山茶油可能通過(guò)增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)氧自由基清除酶SOD的活性，降低氧自由基的含量，從而促進(jìn)胃黏膜的愈合。

3 討 論

圖3 山茶油對(duì)乙酸致胃潰瘍大鼠的血清MDA和SOD的影響（n=10）。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001試驗(yàn)組vs模型組

山茶油是我國(guó)特有的木本油脂，以其富含多種不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)和維生素A、B、D、E等，而成為優(yōu)良的健康型食用油。近年的植物化學(xué)研究顯示，山茶油中含有山茶苷、茶多酚和角鯊烯等多種具有抗炎、抗氧化等生物活性的成分[11-13]，因此山茶油同時(shí)具有醫(yī)療保健的潛在功效。明代李時(shí)珍《本草綱目》和清代趙學(xué)敏《本草綱目拾遺》中即記載山茶油有“驅(qū)蟲(chóng)、益腸胃”、“潤(rùn)腸清胃，殺蟲(chóng)解毒”等功效，在我國(guó)民間也有通過(guò)服用山茶油來(lái)治療胃潰瘍的驗(yàn)方。雖然山茶油治療胃潰瘍功效多被人提及，但迄今為止，尚未見(jiàn)利用現(xiàn)代藥理學(xué)方法，通過(guò)胃潰瘍動(dòng)物模型對(duì)山茶油防治胃潰瘍的功效進(jìn)行證實(shí)。

為了評(píng)價(jià)山茶油對(duì)胃潰瘍的防治效果，本研究通過(guò)水浸束縛法建立了應(yīng)激性胃潰瘍大鼠模型，并通過(guò)冰乙酸法建立了損傷性胃潰瘍大鼠模型，并使用這兩種經(jīng)典的大鼠胃潰瘍模型對(duì)山茶油防治胃潰瘍的功效進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)。我們的研究結(jié)果顯示，每天給予0.5～1.5 mL/kg的山茶油可以劑量依賴(lài)性地預(yù)防由于水浸束縛導(dǎo)致的應(yīng)激性胃潰瘍的發(fā)生，胃黏膜表面水腫和潰瘍面出血得到很大改善，胃潰瘍指數(shù)顯著降低，其中1.5 mL/kg劑量的山茶油可以使胃潰瘍指數(shù)減少57.18%，接近4 mg/kg陽(yáng)性藥奧美拉唑的水平。同時(shí)，每天給予1、1.5 mL/kg的山茶油還能夠顯著促進(jìn)乙酸刺激導(dǎo)致的胃潰瘍病灶的潰瘍面愈合，愈合率分別達(dá)到46.97%和60.19%，其效果也與4 mg/kg的奧美拉唑接近。以上本研究證明，每日口服山茶油可以有效預(yù)防胃潰瘍的產(chǎn)生，并促進(jìn)已有潰瘍面的愈合，從而為使用山茶油治療胃潰瘍提供了明確的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

氧自由基在胃潰瘍發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[1]。在正常動(dòng)物中，體內(nèi)同時(shí)存在完善的自由基生成和清除系統(tǒng)，使器官組織免于氧自由基的損害。在胃潰瘍狀態(tài)下，動(dòng)物體內(nèi)的氧自由基生成量大幅增加而氧自由基清除機(jī)制則明顯減弱，最終導(dǎo)致胃組織內(nèi)積累大量的氧自由基，從而對(duì)機(jī)體造成持續(xù)損傷[1]。山茶油中富含不飽和脂肪酸、角鯊烯等抗氧化活性成分，因此有良好的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，胃潰瘍動(dòng)物血清中SOD活性顯著降低而MDA含量顯著升高，顯示出較嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài)。經(jīng)過(guò)山茶油處理后，胃潰瘍大鼠的血清SOD活性明顯升高，同時(shí)MDA含量顯著降低，表明口服山茶油可顯著增強(qiáng)動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)活性，大幅降低胃潰瘍動(dòng)物的氧化應(yīng)激水平，從而利于胃潰瘍愈合。雖然山茶油還可能通過(guò)其他途徑發(fā)揮抗胃潰瘍作用，但本研究結(jié)果提示，增強(qiáng)機(jī)體消除氧自由基的能力至少部分地參與了山茶油治療胃潰瘍的作用機(jī)制。