單鏈抗體聯(lián)合治療仔豬病毒性腹瀉病的效果研究

張凡慶　陳玉雪　楊　亮　龔建培　朱建國*

（1上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院/上海市獸醫(yī)生物技術重點實驗室，上海 200240；2上海富朗特動物保健股份有限公司，上海 201502；3浙江海正動物保健品有限公司，浙江臺州 318099）

隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，豬場的規(guī)模逐漸變大，豬群數(shù)量變多，同時一些疾病非常容易在豬場傳播，特別是豬腹瀉病。目前豬腹瀉病的發(fā)病原因分為兩類：傳染性疾病引起的腹瀉和非傳染性因素造成的腹瀉。傳染性腹瀉是由病毒、細菌引起，病毒包括流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒等；細菌包括大腸桿菌、沙門氏菌等。非傳染性腹瀉因素包括仔豬消化功能不全、日糧抗原過敏、食入腐敗飼料、應激因素等。非傳染性腹瀉危害小且治愈快，而傳染性疾病危害較大，特別是病毒性疾病，通常迅速感染整個豬場，造成仔豬大量腹瀉和死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

病毒性腹瀉最常見的病原有兩種：流行性腹瀉病毒（PEDV）和傳染性胃腸炎病毒（TGEV）[1,2]。PEDV和TGEV都能夠引起豬的嘔吐、水樣腹瀉和脫水癥狀，各年齡段都能發(fā)病，2周齡以內(nèi)的仔豬發(fā)病率和死亡率最高，甚至達到100%。TGEV和PEDV均屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，病毒粒子呈圓形或橢圓形，外有囊膜，直徑80～100 nm，為RNA病毒。病毒結(jié)構(gòu)蛋白包括纖突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N），這些病毒蛋白介導了病毒的感染、入侵和釋放等多個過程[3]。眾所周知，這兩種病毒感染所致的仔豬腹瀉表現(xiàn)為發(fā)病急、機體脫水嚴重、營養(yǎng)狀況惡化，經(jīng)常未來得及治療發(fā)病仔豬就已衰竭死亡。這一現(xiàn)象在本課題組前期利用單鏈抗體進行現(xiàn)場治療時也曾出現(xiàn)。

在生產(chǎn)實踐中，許多一線技術人員通常將奶粉與溫開水沖泡后代替母乳飼喂仔豬，補充仔豬所需的各種營養(yǎng)，提高仔豬免疫力和快速促進仔豬的生長。此外，當仔豬發(fā)生如腹瀉病等疾病時，飼喂乳制品也能夠加速病畜的康復，提高存活率。受此啟發(fā)，本研究將課題組前期制備、經(jīng)仔豬保護試驗證實具有良好保護效果的抗PEDV和TGEV的scFv與奶粉聯(lián)合應用，分析該方法在發(fā)病豬場的臨床治療價值。

1　材料

His-Trap純化樹脂購自英國GE公司；PBS緩沖液購自Thermo公司；5×SDS-PAGE電泳緩沖液購自碧云天生物科技有限公司。

2　方法

2.1　scFv的純化

從-20℃取出凍存的攜帶scFv基因的菌株（分別與pET-28a(+)載體連接），接種至2YT-K平板上，37℃培養(yǎng)過夜。第2天挑取單菌落接種至2YT液體培養(yǎng)基中，待OD600nm達到0.6時加入10 mM IPTG，過夜誘導。將誘導后的菌液超聲破碎后取上清，使用AKTA purifier純化系統(tǒng)進行純化。

取純化后的少量樣品加入5×SDS-PAGE電泳緩沖液，煮沸10分鐘后進行10%SDS-PAGE電泳，分析純化后蛋白的純度。

2.2　仔豬腹瀉治療試驗

試驗在一個正在流行仔豬腹瀉病的豬場進行。該豬場先前的ELISA和PCR實驗證實豬群感染了PEDV和TGEV，仔豬感染后連續(xù)腹瀉和嘔吐，4～5天出現(xiàn)大量死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)胃內(nèi)有大量內(nèi)容物，胃壁和小腸出血，伴有腸壁臌脹和變薄，腸系膜淋巴結(jié)出血；糞便呈水樣黃色。

仔豬的分組和處理情況見表1。一共分為3個處理組，第1個處理組包括母豬欄號A和B，對仔豬灌胃抗體和奶粉；第2個處理組包括母豬欄號C和D，對仔豬灌胃抗體，不使用奶粉；第3個處理組包括母豬欄號E和F，對仔豬只灌服奶粉，不灌服抗體?？贵w每次灌胃量為3 mL，濃度為0.5 mg/mL，灌胃時間為0小時、24小時和72小時；人工喂奶時間分別為10小時、14小時和36小時。抗體處理后24小時開始記錄仔豬的拉稀和存活情況。

3　結(jié)果

3.1　抗PEDV和TGEV scFv的純化

將原核表達的菌液使用超聲破碎儀進行裂解，裂解后的產(chǎn)物離心后取上清用AKTApurifier系統(tǒng)進行純化。紫外分光光度計測定PEDV scFv和TGEV scFv的OD260nm/OD280nm值分別為0.882和0.865，說明蛋白純度較高。根據(jù)蛋白濃度=（1.55×OD280nm）-（0.76×OD260nm）公式計算得出PEDV scFv和TGEV scFv的濃度分別為1.622 mg/mL和1.681 mg/mL。

表1　試驗仔豬分組情況

將純化后的scFv進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果證實純化的蛋白在28 kDa處出現(xiàn)單一的條帶，且純度較高（見圖 1）。

圖1　scFv的SDS-PAGE電泳

3.2　仔豬腹瀉治療實驗

scFv+奶粉處理組（A、B）的平均存活率為72.7%，scFv處理組（C、D）的平均存活率為65%，只加奶粉組（E、F）的平均存活率僅為8.3%。t檢驗計算得出scFv+奶粉處理組、scFv組的治療效果明顯優(yōu)于只加奶粉組（＜0.01） （見圖2）。scFv+奶粉處理組比scFv處理組存活率提高了7.7%，雖然t檢驗差異不顯著，但也能看出添加奶粉對提高機體免疫力有一定效果。

4　討論

4.1　scFv純化方法

原核表達的蛋白產(chǎn)物通常使用His標簽，便于純化。本研究中的scFv基因序列與pET-28（+）載體連接，也攜帶His標簽。普通實驗室純化使用重力純化蛋白，雖然操作方便，但是純化量不高。為了滿足臨床大量應用的需要，本研究使用了AKTA蛋白快速純化系統(tǒng)純化蛋白，該系統(tǒng)使用惰性氣體管道，環(huán)境溫和，可以減少對蛋白質(zhì)活性的影響；能夠快速大量純化重組蛋白，進行中試生產(chǎn)；具有3個分析器（紫外/可見光檢測器、電導檢測器、pH檢測器），能夠直接對純化樣品分析[6]。

表2　仔豬存活情況

圖2　仔豬腹瀉治療的存活率

4.2　scFv治療效果

目前對PEDV和TGEV的防治以疫苗免疫為主。TGEV的變異程度較PEDV低，因此比較容易防控。PEDV在2010年時出現(xiàn)了變異株，傳統(tǒng)的疫苗不能對變異株起到保護作用，造成了該病在豬場的大規(guī)模流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[5]。本研究中使用的scFv針對目前變異的PEDV，先前的細胞和動物實驗也證明該scFv具有中和及保護作用。

本研究證實scFv對PEDV和TGEV的共同感染具有很好的治療效果。scFv單獨處理后仔豬的存活率達到65.0%，而不使用scFv的仔豬存活率只有8.3%，證明scFv具有很好的治療作用。同時scFv+奶粉共同處理組使仔豬的存活率進一步提高到72.7%，提示抗體和奶粉具有共同使用的臨床價值。值得注意的是，本次實驗中scFv與奶粉為分開飼喂，而先前的研究表明當抗體與乳汁共同飼喂時，乳汁中的成分還能夠減少抗體被胃酸的破壞，提高抗體的有效治療量[7]。將抗體與奶粉同時投喂仔豬是否具有更好的治療效果有待于進一步研究。