轉(zhuǎn)CmTre1基因RNA干擾水稻的室內(nèi)和田間抗蟲(chóng)性鑒定

夏浪 杜娟 李尚偉 趙鳳

摘 要：稻縱卷葉螟是一種主要的水稻害蟲(chóng)，海藻糖酶是昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成通路上的關(guān)鍵酶之一。該研究對(duì)轉(zhuǎn)稻縱卷葉螟可溶性海藻糖酶基因（CmTre1）雙鏈RNA（dsRNA）水稻進(jìn)行了室內(nèi)和田間抗蟲(chóng)性鑒定。葉片測(cè)定結(jié)果表明，取食轉(zhuǎn)CmTre1基因dsRNA水稻株系608的稻縱卷葉螟死亡率為70.00%，校正死亡率為50.95%。定量PCR檢測(cè)表明，幼蟲(chóng)取食608株系后其體內(nèi)CmTre1基因的mRNA水平下降59.00%，該基因的表達(dá)被抑制。田間抗蟲(chóng)性檢測(cè)結(jié)果表明，608株系的卷葉率為15.06%，白葉率為13.98%，與對(duì)照差異顯著。轉(zhuǎn)CmTre1基因RNA干擾（RNAi）水稻對(duì)稻縱卷葉螟具有抗性。該研究為利用RNAi技術(shù)對(duì)稻縱卷葉螟進(jìn)行綠色防控奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：稻縱卷葉螟；海藻糖酶；RNA干擾；抗蟲(chóng)性

中圖分類號(hào)：Q966

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2018）03-0074-05 國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.03.013

Indoor and Field Identification of Insect Resistant of CmTre1-transgenic RNAi Rice

XIA Lang，DU Juan， LI Shangwei*， ZHAO Feng

（Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of Mountainous Region， Institute of Entomology， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550002 China）

Abstract：：The rice leaf folder， Cnaphalocrocis medinalis， is a major rice pest. Trehalase （Tre） is one of the key enzymes in the chitin synthesis pathway of insects. In this study， we identified the insect resistance of rice that was introduced the double-stranded RNA （dsRNA） of soluble trahalase gene from C. medinalis （CmTre1） indoors and in the fields. Results of leaf assay showed that mortality rate of C. medinalis fed on the dsRNA-transgenic rice line 608 was 70.00% and the corrected mortality rate was 50.95%. Real-time quantitative PCR （RT-qPCR） analysis demonstrated that mRNA level of CmTre1 in C. medinalis fed on rice 608 dropped by 69.00%， and the expression of CmTre1 gene was inhibited. Results of insect resistance test in the fields indicated that the average rate of rolled and white leaves for rice 608 was 15.06% and 13.98%， respectively， which was significantly different from the control. The CmTre1 dsRNA-transgenic rice was resistant to C. medinalis. This study would lay the foundation for the green control of C. medinalis using RNA interference （RNAi） technology.

Key words：Cnaphalocrocis medinalis； trehalase； RNA interference； insect resistance

稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）是水稻的主要害蟲(chóng)之一，對(duì)該害蟲(chóng)的有效防治是保證糧食安全生產(chǎn)的重要問(wèn)題。目前，在稻縱卷葉螟防治工作中仍以化學(xué)殺蟲(chóng)劑為主要手段，然而長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)造成一系列問(wèn)題，如環(huán)境污染、對(duì)非靶標(biāo)生物有負(fù)面影響以及害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性等[1]。因此，人們急需尋找一種新型殺蟲(chóng)方法來(lái)防治稻縱卷葉螟。

海藻糖是昆蟲(chóng)血淋巴中主要的糖類物質(zhì)，海藻糖酶可將一分子海藻糖分解為兩分子葡萄糖。昆蟲(chóng)海藻糖酶根據(jù)是否存在跨膜結(jié)構(gòu)，可分為兩類：可溶性海藻糖酶（soluble trehalase，Tre1）與膜結(jié)合型海藻糖酶（membrane-bound trehalase，Tre2）[2]?？扇苄院Ｔ逄敲阜纸饧?xì)胞內(nèi)海藻糖，而膜結(jié)合型海藻糖酶分解胞外（主要為食物中）海藻糖[3]。第一個(gè)可溶性海藻糖酶基因于1992年從黃粉蟲(chóng)（Tenebrio molitor）中被克隆[4]，主要在中腸、馬氏管和卵巢中表達(dá)。膜結(jié)合型海藻糖酶基因，直到2005年才從家蠶（Bombyx mori）中獲得[5]，主要在脂肪體、中腸和馬氏管中表達(dá)。研究表明，多數(shù)昆蟲(chóng)體內(nèi)都存在一個(gè)膜結(jié)合型和一個(gè)可溶性海藻糖酶基因，僅少數(shù)昆蟲(chóng)如異色瓢蟲(chóng)（Harmonia axyridis）[6]和褐飛虱（Nilaparvata lugens）[7]中找到多種可溶性海藻糖酶基因。海藻糖酶在昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成與能量代謝過(guò)程當(dāng)中扮演著十分重要的角色。因此，越來(lái)越多的科研工作者把海藻糖酶作為害蟲(chóng)防治的一個(gè)理想靶標(biāo)。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制（post-transcriptional gene silencing，PTGS）[8]，具有特異性和高效性。RNAi技術(shù)可被用于探索基因功能、腫瘤治療及生物防治等方面。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)昆蟲(chóng)都具有系統(tǒng)性RNAi，對(duì)某些昆蟲(chóng)如赤擬谷盜（Tribolium castaeum）和蟋蟀（Gryllus bimaculatus）的親本實(shí)施RNAi，在其子代中仍可觀察到基因沉默現(xiàn)象[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將稻縱卷葉螟可溶性海藻糖酶基因CmTre1的雙鏈RNA （ds RNA）導(dǎo)入到水稻中，培育了轉(zhuǎn)CmTre1基因RNAi水稻。本研究是以這些水稻株系為研究對(duì)象，在室內(nèi)和田間鑒定其抗蟲(chóng)性，以期為利用RNAi技術(shù)對(duì)稻縱卷葉螟進(jìn)行綠色防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)與水稻

供試水稻材料為轉(zhuǎn)CmTre1基因dsRNA的中花11。供試?yán)ハx(chóng)為稻縱卷葉螟幼蟲(chóng)，飼養(yǎng)條件為 26±1℃，相對(duì)濕度70%～80%，光周期14L∶10D。

1.2 主要試劑與儀器

HP Total RNA Kit購(gòu)自美國(guó) Omega Bio-tek 公司；大腸桿菌Escherichia coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞、DL2000 DNA marker、PrimeScript RT-PCR Kit 、LA Taq DNA聚合酶均購(gòu)于大連 TaKaRa公司；PCR儀（C1000 Thermal Cycler）和iTaq Universal SYBR Green Supermix 采購(gòu)于美國(guó) Bio-Rad 公司；離心管、PCR耗材及其他常規(guī)試劑與耗材均購(gòu)自于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

取稻縱卷葉螟3齡幼蟲(chóng)50～100 mg，液氮研磨后，用HP Total RNA Kit（Omega）提取總RNA，具體過(guò)程按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000分別檢測(cè)總RNA的完整性和純度。按照 采用PrimeScript RT-PCR Kit（TaKaRa）試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.4 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)

利用 Primer 6.0 針對(duì)稻縱卷葉螟CmTre1基因的編碼區(qū)設(shè)計(jì)熒光定量 PCR （RT-qPCR）引物 CmTre1q-F 和 CmTre1q-R（表 1），檢測(cè)RNAi后稻縱卷葉螟體內(nèi)CmTre1的mRNA表達(dá)水平。以稻縱卷葉螟看家基因CmActin（GenBank登錄號(hào)：JN029806）為內(nèi)參對(duì)照。

1.5 室內(nèi)抗蟲(chóng)性檢測(cè)

用葉片測(cè)定法進(jìn)行RNAi水稻的室內(nèi)抗蟲(chóng)性鑒定。將直管（12 cm × 3 cm）一端用包裹有棉花的細(xì)紗布封口，分別剪取3個(gè)轉(zhuǎn)CmTre1基因dsRNA水稻株系（605、608和622）的 5 片葉放入不同的直管中。每管接15頭稻縱卷葉螟3齡幼蟲(chóng)，每隔 12 h，觀察記錄幼蟲(chóng)取食、表型及存活情況。每天定時(shí)在直管兩端噴灑保鮮液，3 d更換一次葉片，7 d后統(tǒng)計(jì)死亡率，用存活的幼蟲(chóng)進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。 死亡率計(jì)算公式：死亡率=死亡蟲(chóng)數(shù)/總蟲(chóng)數(shù)；校正死亡率計(jì)算公式：校正死亡率=（實(shí)驗(yàn)組死亡率-對(duì)照組死亡率）/（1-對(duì)照組死亡率）。設(shè)3次重復(fù)，以正常水稻葉作為對(duì)照。

1.6 CmTre1基因沉默效應(yīng)檢測(cè)

稻縱卷葉螟取食轉(zhuǎn) CmTre1 基因dsRNA水稻葉片7 d后，分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各2頭存活的幼蟲(chóng)，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系：1 μL cDNA，20 μmol/L上/下游引物各0.5 μL，10 μL 2× iTaq universal SYBR Green supermix （Bio-Rad），補(bǔ)加滅菌水到總體積20 μL。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性10 s，55℃ 退火20 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用CFX Manager軟件（Bio-Rad）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄與分析。

1.7 田間抗蟲(chóng)性檢測(cè)

將轉(zhuǎn)CmTre1基因dsRNA水稻株系以小區(qū)塊種植，選35株罩上尼龍網(wǎng)，至分蘗盛期在每個(gè)網(wǎng)中的水稻上人工接種50頭稻縱卷葉螟低齡幼蟲(chóng)，每隔7 d觀察一次，30 d后統(tǒng)計(jì)水稻的卷葉率和白葉率。平均每株卷葉率=卷葉數(shù)/網(wǎng)中水稻葉片總數(shù)/35；平均每株白葉率=白葉數(shù)/網(wǎng)中水稻葉片總數(shù)/35。每個(gè)處理重復(fù)3次，以正常水稻作為對(duì)照。

1.8 數(shù)據(jù)與分析

采用 2-ΔΔCt法分析稻縱卷葉螟取食轉(zhuǎn)CmTre1基因dsRNA水稻葉片后，其體內(nèi)CmTre1基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制柱形圖。采用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件中方差分析（ANOVA）的Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 取食情況及表型觀察

在接蟲(chóng) 2 d和 4 d后，觀察稻縱卷葉螟的活力，通過(guò)其對(duì)水稻的取食情況判斷其生命活力強(qiáng)度。用轉(zhuǎn)CmTre1基因dsRNA水稻葉片飼喂稻縱卷葉螟 2 d后，可以清楚地看到，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的水稻葉片沒(méi)有明顯的差別，表明稻縱卷葉螟活力差不多；飼喂 4 d后，對(duì)照組水稻葉片被取食十分嚴(yán)重，而實(shí)驗(yàn)組水稻葉片并沒(méi)有明顯的變化（圖1），說(shuō)明稻縱卷葉螟在取食了RNAi水稻葉片后其生命活力明顯受到抑制。接蟲(chóng) 7 d后，有的蟲(chóng)體變黃，活動(dòng)緩慢，部分蟲(chóng)體畸形發(fā)育，有的還出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；不能正?；迹行┰诨计陂g死亡，只有極少部分能化蛹，但是蛹比較小，活力較低（圖2）。

2.2 室內(nèi)抗蟲(chóng)性鑒定

在直管中接蟲(chóng)7 d后，取食轉(zhuǎn)CmTre1基因dsRNA水稻株系605、608和622的稻縱卷葉螟死亡率分別為60.00%、70.00%和66.67%，校正死亡率分別為 31.27%、50.95% 和43.49%，與對(duì)照組（701）相比差異顯著（表2）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)CmTre1基因dsRNA水稻對(duì)稻縱卷葉螟具有致死效應(yīng)，株系608具有較好的抗蟲(chóng)效果。

2.3 CmTre1基因mRNA表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，稻縱卷葉螟 3 齡幼蟲(chóng)取食轉(zhuǎn) CmTre1 基因dsRNA水稻葉片7 d 后，其體內(nèi)可溶性海藻糖酶基因的表達(dá)水平相比對(duì)照組明顯下降；取食605、608和622后，該基因的mRNA表達(dá)水平分別下降了55.00%、59.00%和48.00%，與對(duì)照組差異顯著（圖3）。

2.4 田間抗蟲(chóng)性鑒定

在田間人工接蟲(chóng) 30 d后，轉(zhuǎn)CmTre1基因dsRNA水稻株系605、608和622的卷葉率分別為 12.20%、15.06%和14.81%，相較于對(duì)照，分別減少了11.50%、8.64%和8.89%；白葉率分別為11.43%、13.98%和13.20%，相對(duì)于對(duì)照，分別減少了11.22%、8.67%和9.45% （表3）。田間與室內(nèi)抗蟲(chóng)性鑒定結(jié)果基本一致，稻縱卷葉螟幼蟲(chóng)選擇性拒食RNAi水稻，利用RNAi技術(shù)防治稻縱卷葉螟具有一定的效果。

3 結(jié)論與討論

海藻糖酶是昆蟲(chóng)能量代謝中的一類酶，也是昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成通路中的第一個(gè)酶，它參與昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育、蛻皮及繁殖等許多重要生理過(guò)程[12-13]?？扇苄秃Ｔ逄腔?qū)ハx(chóng)表皮幾丁質(zhì)合成影響更大，而膜結(jié)合型海藻糖酶基因影響中腸幾丁質(zhì)的合成[14-15]。在褐飛虱中，TRE的dsRNA能夠有效地抑制海藻糖酶基因mRNA的表達(dá)，影響幾丁質(zhì)的合成與降解，從而導(dǎo)致幾丁質(zhì)含量下降、蛻皮困難及死亡[16，17]。在東亞飛蝗中，LmTre-1的mRNA 表達(dá)特性與幾丁質(zhì)合成酶1 基因非常相似，結(jié)果表明該基因可能與體壁幾丁質(zhì)的合成相關(guān)[18]。本研究對(duì)轉(zhuǎn)CmTre1基因dsRNA水稻進(jìn)行了室內(nèi)和田間的抗蟲(chóng)性鑒定，從總體來(lái)看，株系608的抗蟲(chóng)性較好一些。該株系僅僅是導(dǎo)入了CmTre1基因dsRNA，下一步我們計(jì)劃在水稻中同時(shí)導(dǎo)入稻縱卷葉螟2個(gè)海藻糖酶基因和2個(gè)幾丁質(zhì)合成酶基因的dsRNA，以期當(dāng)該害蟲(chóng)取食這些轉(zhuǎn)基因RNAi水稻時(shí)其體內(nèi)這2類基因都被沉默，實(shí)現(xiàn)對(duì)該害蟲(chóng)的生物防治。

目前，利用植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)，讓昆蟲(chóng)取食植物中表達(dá)的來(lái)自昆蟲(chóng)重要功能基因的dsRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)昆蟲(chóng)重要基因沉默方面的研究越來(lái)越多。Baum等[19]通過(guò)植物介導(dǎo)的昆蟲(chóng)腸道特異基因的RNAi技術(shù)成功獲得了對(duì)根螢葉甲（Diabrotica virgifera）有抗性作用的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)性玉米，這種方法很大程度上推動(dòng)了轉(zhuǎn)基因RNAi作物抗蟲(chóng)的研究進(jìn)展。Mao等[20]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在煙草和擬南芥中表達(dá)了靶向棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）細(xì)胞色素P450基因CYP6AE14的dsRNA，當(dāng)棉鈴蟲(chóng)進(jìn)食轉(zhuǎn)基因植物后，CYP6AE14的表達(dá)水平顯著下調(diào)，幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育受阻。Zha等[21]將褐飛虱（Nilaparvata lugens） 中腸里高表達(dá)的3個(gè)基因NlHT1、Nlcar 和Nltry 轉(zhuǎn)入到水稻中，在水稻中表達(dá)它們的dsRNA，褐飛虱取食后，這3個(gè)基因均有效地被沉默。這些研究結(jié)果表明，我們可以應(yīng)用轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)沉默害蟲(chóng)重要功能基因，培育抗蟲(chóng)作物新品種，實(shí)現(xiàn)對(duì)害蟲(chóng)的綠色防控。

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