益胃消瘀顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉霞　徐沖　吳文輝　郭小紅　孫全　田鋒亮

摘要：目的 建立益胃消瘀顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜法（TLC）定性鑒別白術(shù)、當(dāng)歸和石斛，采用HPLC同時(shí)測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及人參皂苷Re的含量。結(jié)果 TLC斑點(diǎn)清晰，陰性對照無干擾。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re分別在0.067 2～0.672 ?g（r=0.999 6）、0.501 2～5.012 ?g（r=0.999 6）、0.326 5～3.265 ?g（r=0.999 6）、0.098 3～0.983 ?g（r=0.999 7）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為96.32%、96.45%、101.23%、97.89%，RSD分別為1.3%、1.5%、1.7%、1.7%。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可用于益胃消瘀顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：益胃消瘀顆粒；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；三七皂苷R1；人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb1；人參皂苷Re

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.017

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）03-0077-04

Abstract： Objective To establish the quality standard for Yiwei Xiaoyu Granules. Methods TLC was used for the qualitative analyses of Atractylodis Macrocephalae Rhizoma， Angelicae Sinensis Radix and Dendrobii Caulis； HPLC was applied to determine the contents of notoginsenoside R1， ginsenoside Rg1， ginsenoside Rb1 and ginsenoside Re. Results The TLC spots were clear and free from negative interference. Notoginsenoside R1， ginsenoside Rg1， ginsenoside Rb1 and ginsenoside Re showed good linear relationships within the ranges of 0.067 2–0.672 ?g （r=0.999 6）， 0.501 2–5.012 ?g （r=0.999 6）， 0.326 5–3.265 ?g （r=0.999 6）， 0.098 3–0.983 ?g （r=0.999 7）， whose average recoveries were 96.32% （RSD=1.3%）， 96.45% （RSD=1.5%）， 101.23% （RSD=1.7%）， and 97.89% （RSD=1.7%）， respectively. Conclusion This method is accurate， reliable， and reproducible， which can be used for the quality control of Yiwei Xiaoyu Granules.

Keywords： Yiwei Xiaoyu Granules； quality standard； notoginsenoside R1； ginsenoside Rg1； ginsenoside Rb1； ginsenoside Re

益胃消瘀顆粒由紅參、三七、娑羅子、白術(shù)、當(dāng)歸、石斛等10味中藥組成，具有溫脾益氣養(yǎng)陰、疏肝和胃化瘀功效，臨床主要用于治療胃脘痞滿、胃中嘈雜或隱痛、食納減少等脾陽胃陰不足、氣滯夾瘀證的慢性淺表性胃炎及萎縮性胃炎伴有腸上皮化生、異型增生者[1]。該方原以湯劑形式在本院應(yīng)用10余年，臨床療效確切且安全可靠，現(xiàn)擬將湯劑改成顆粒劑，以更好地適應(yīng)患者需求。

本課題組前期已建立了益胃消瘀顆粒的制備工藝：紅參、三七粉碎成細(xì)粉，過篩，其余娑羅子等8味藥加水煎煮，煎液過濾，合并濾液，濃縮至適量，與上述粉末混勻，干燥，粉碎成細(xì)粉，加糊精適量，制成顆粒，干燥，混勻，包裝，即得。為了更好地控制益胃消瘀顆粒的質(zhì)量，保證臨床用藥安全有效，需建立益胃消瘀顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方中紅參、三七共為君藥，以粉末形式加入制粒，2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Re為指標(biāo)性成分對紅參進(jìn)行定量評價(jià)，以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1為指標(biāo)性成分對三七進(jìn)行定量評價(jià)，故本研究采用HPLC同時(shí)測定益胃消瘀顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Re多指標(biāo)性成分，采用TLC對方中白術(shù)、當(dāng)歸、石斛進(jìn)行定性鑒別，控制益胃消瘀顆粒的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agillent-1260高效液相色譜儀（美國Agillent公司），SymmetryShieldTM RP18色譜柱（5 ?m，250 mm×4.6 mm），KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），JA3003J型電子密度天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），AE-200型電子天平（天津METTLER公司），智能恒溫電熱套（ZNHW-Ⅱ型，河南愛博特公司）。

益胃消瘀顆粒（批號160321、160322、160323），重慶市中醫(yī)院制劑室提供。阿魏酸、石斛酚、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re對照品（批號分別為110773-201313、111875-201202、0745-200006、0703-200118、110704-201124、754-200115），白術(shù)對照藥材（批號0925-200005），中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 白術(shù)

取樣品（批號160321、160322、160323）10 g，加水煎煮2 h，過濾，濾液用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取白術(shù)對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。按處方稱取除白術(shù)外的藥材，按制劑工藝制得缺白術(shù)陰性制劑，同法制成陰性對照溶液。吸取上述5種溶液各10 ?L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸（9.5∶0.5∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。

2.1.2 當(dāng)歸

取樣品（批號160321、160322、160323）10 g，加1%碳酸氫鈉溶液50 mL，超聲處理10 min，離心，取上清液，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2?3，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状糽 mL使溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對照藥材1 g，加1%碳酸氫鈉溶液50 mL，同法制成對照藥材溶液。再取阿魏酸對照品，加甲醇制成每l mL含l mg的溶液，作為對照品溶液。按處方稱取除當(dāng)歸外的藥材，按制劑工藝制得缺當(dāng)歸陰性制劑，同法制成陰性對照溶液。吸取上述6種溶液各10 ?L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-甲醇-冰醋酸（10∶1∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。

2.1.3 石斛

取樣品（批號160321、160322、160323）10 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。另取石斛酚對照品，加三氯甲烷制成每1 mL含0.4 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方稱取除石斛外的藥材，按制劑工藝制得缺石斛陰性制劑，同法制成陰性對照溶液。吸取上述5種溶液各10 ?L，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（12∶6∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

采用Waters C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，81%B；25～50 min，81%→79%B；50～55 min，79%→69%B；55～80 min，69%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：203 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 ?L。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Re對照品適量，用甲醇配制成濃度分別為0.067 2、0.501 2、0.326 5、0.098 3 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取本品約15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用水飽和正丁醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，置分液漏斗中，加氨試液洗滌2次，每次15 mL，取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備

按處方量并以相同制劑工藝制備缺紅參和三七的陰性樣品，稱取約15 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果所測成分色譜峰與樣品中其他組分色譜峰基線分離，陰性無干擾，見圖1。

2.2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液1、2、4、8、10 ?L，按“2.2.1”項(xiàng)下條件測定，以進(jìn)樣量（?g）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各成分回歸方程。三七皂苷R1：Y=278.810 5X-1.185 6（r=0.999 6）；人參皂苷Rg1：Y=188.312 6X+1.385 2（r=0.999 6）；人參皂苷Rb1：Y=243.501 8X+0.715 1（r=0.999 6）；人參皂苷Re：Y=207.456 5X+2.385 7（r=0.999 7）。4種成分依次在0.067 2～0.672 ?g、0.501 2～5.012 ?g、0.326 5～3.265 ?g、0.098 3～0.983 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液5 ?L，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re的RSD分別為1.6%、1.4%、1.5%、0.9%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批益胃消瘀顆粒6份，每份約15 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re的RSD分別為1.7%、1.2%、1.0%、1.5%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取益胃消瘀顆粒約15 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12 h按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re的RSD分別為1.8%、1.0%、0.9%、1.3%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號160321）1.0 g，共24份，分別精密加入“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，同時(shí)按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1，表明本方法回收率良好。

2.2.11 樣品含量測定

取3批樣品，按上述方法測定，結(jié)果見表2。

3 討論

白術(shù)的化學(xué)成分主要為揮發(fā)油，對白術(shù)及其制劑的TLC鑒別主要是對其揮發(fā)油類成分的鑒別[2]103。目前益胃消瘀顆粒的制備工藝沿用傳統(tǒng)方法，通過水煎煮制成顆粒劑，故需對白術(shù)的水溶性成分進(jìn)行鑒別。本試驗(yàn)曾分別采用甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶2∶0.2）、三氯甲烷-丙酮-甲酸（9.5∶0.5∶0.5）展開系統(tǒng)[3-4]，結(jié)果表明，以三氯甲烷-丙酮-甲酸（9.5∶0.5∶0.5）為展開劑，紫外光365 nm波長下檢視，樣品斑點(diǎn)清晰，分離效果較好。

當(dāng)歸的主要化學(xué)成分包括揮發(fā)油和水溶性成分，其中阿魏酸是當(dāng)歸水溶性部分主要有效成分之一。本試驗(yàn)分別考察了苯-甲醇-冰醋酸（10∶1∶0.5）、正己烷-三氯甲烷-冰醋酸（6∶4∶1）、甲苯-乙酸乙酯-甲酸（9∶1∶1）展開系統(tǒng)[2]133[5-6]，發(fā)現(xiàn)以苯-甲醇-甲酸（10∶1∶0.5）為展開系統(tǒng)時(shí)分離度高，斑點(diǎn)清晰。

經(jīng)本院藥檢室鑒定，益胃消瘀顆粒所使用的石斛為黃草石斛。對其TLC鑒別，試用2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）石斛項(xiàng)下流蘇石斛等薄層色譜鑒別方法，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（3∶2）為展開劑，但供試品展開效果不理想，雖然顯色后可見石斛酚的斑點(diǎn)，但斑點(diǎn)不夠圓整。故又分別考察了石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（12∶6∶1）、環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（1∶2∶3）展開系統(tǒng)[2]92[7]。結(jié)果表明，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（12∶6∶1）為展開劑時(shí)，陰性無干擾，斑點(diǎn)圓整清晰，分離度較好。

益胃消瘀顆粒處方中，三七和紅參共為君藥，藥理研究表明，紅參的主要有效成分人參皂苷類具有抑制胃癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[8-10]，三七及其主要有效成分三七皂苷R1能在一定程度上減輕胃缺血-再灌注黏膜損傷，且三七能逆轉(zhuǎn)大鼠胃黏膜上皮異型增生和腸上皮化生等[11-13]，故本試驗(yàn)選擇三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Re作為益胃消瘀顆粒含量測定指標(biāo)。在Waters C18色譜柱，乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脫（0～25 min，81%B；25～50 min，81%→79%B；50～55 min，79%→69%B；55～80 min，69%B），203 nm波長條件下，4個(gè)指標(biāo)成分分離度良好，且陰性對照未見干擾。在甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，峰2和峰3不易分離，且柱壓相對較高。

綜上所述，本試驗(yàn)所建立的白術(shù)、當(dāng)歸、石斛的TLC特征斑點(diǎn)清晰，陰性樣品溶液均無干擾，且分離度好；三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Re的HPLC含量測定方法可靠易行，專屬性好，可為益胃消瘀顆粒質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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（收稿日期：2017-05-31）

（修回日期：2017-06-16；編輯：陳靜）